查 醒，賀小進(jìn)，2，宋 兵，杜衛(wèi)東，張 妍，阮 健，吳 歡，曹云霞，2

SPATA22基因多態(tài)性與中國漢族非梗阻性無精子癥的易感性關(guān)聯(lián)分析

查 醒1，賀小進(jìn)1，2，宋 兵1，杜衛(wèi)東3，張 妍3，阮 健3，吳 歡1，曹云霞1，2

目的探討精子發(fā)生相關(guān)基因22（SPATA22）基因的7個標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族非梗阻性無精子癥（NOA）的易感性的相關(guān)性。方法選取368例已生育的男性（對照組）和361例NOA患者（病例組），應(yīng)用Sequenom MassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)檢測對照組和病例組SPATA22基因7個標(biāo)簽SNPs的基因型。應(yīng)用Plink 1.07軟件及Haploview軟件對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，比較對照組與病例組SPATA22基因的最小等位基因頻率（MAF）基因型及單體型的差異。結(jié)果SPATA22基因7個標(biāo)簽SNPs的MAF、基因型及單體型在對照組與病例組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論SPATA22基因7個標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族男性NOA的易感性可能不相關(guān)。

不育癥；非梗阻性無精子癥；SPATA22基因；單核苷酸多態(tài)性

全球不孕癥的患病率約為10%，其中男方因素約占一半［1］。目前多數(shù)男性不育發(fā)病機(jī)制尚不明確，稱為特發(fā)性不育癥［2］。非梗阻性無精子癥（non －obstructive azoospermia，NOA）是臨床上常見的、嚴(yán)重的不育癥之一，雖然小部分NOA患者可通過卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）獲得自己的生物學(xué)后代，但I(xiàn)CSI繞過自然選擇，一些遺傳異常可能會傳至子代［3－7］。因此，深入研究NOA的分子機(jī)制有利于子代人口健康。精子發(fā)生相關(guān)基因22（spermatogenesis associated 22，SPATA22）是在脊椎動物中新發(fā)現(xiàn)的一個保守基因，位于人類第17號染色體［8］。研究［8－10］證明，SPATA22基因是生殖細(xì)胞減數(shù)分裂早期的關(guān)鍵基因，其突變可導(dǎo)致不育癥。SPATA22基因在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，該研究探討SPATA22基因多態(tài)性與中國漢族男性NOA發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2008年3月～2014年3月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心男科門診就診的NOA患者361例作為病例組。入選標(biāo)準(zhǔn)：NOA患者均行≥3次精液離心檢查，未見精子（參照第5版WHO人類精液分析技術(shù)手冊）［11］，行睪丸組織病理檢查顯示睪丸生精功能減退、阻滯或唯支持細(xì)胞綜合征。排除標(biāo)準(zhǔn)：①染色體核型分析異常；②Y染色體微缺失；③附睪飽滿或存在結(jié)節(jié)；④隱睪、睪丸炎、精索靜脈曲張、腹股溝疝、輸精管結(jié)扎等病史。選擇同期有正常生育史，精液檢查正常，排除生殖道疾病，因女方不孕因素就診于我中心的男性共368例作為對照組。采集所有研究對象的外周靜脈血3～4 ml，置于5 ml的EDTA抗凝管中，－80℃保存待統(tǒng)一測定。研究對象之間均無親緣關(guān)系且均為漢族人。本研究獲得安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2008035），且所有入選對象簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取和標(biāo)準(zhǔn)化 按照德國QIAGEN公司的基因組DNA提取試劑盒（51306）使用說明書進(jìn)行操作，提取樣本基因組DNA后電泳，檢測濃度后，標(biāo)準(zhǔn)化至15～20 ng／μl，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SNP點(diǎn)選擇 本研究依據(jù)國際人類單倍體圖計劃網(wǎng)站（http：／／hapmap.ncbi.nlm.nih.gov／）提供的基因型，運(yùn)用Haploview軟件及前人研究篩選SPATA22基因7個標(biāo)簽SNPs，分別為：rs1488689、rs1488690、rs2171582、rs7209613、rs2291604、rs17822627、rs9901726。要求最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥0.05。PCR擴(kuò)增及延伸產(chǎn)物由Sequenom MassArray Assay Designer 3.0軟件設(shè)計并由Invitrogen（上海）基因技術(shù)有限公司合成，見表1。

表1 SPATA22基因7個SNPs位點(diǎn)引物序列

1.2.3 基因分型 利用Sequenom MassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)對7個標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。參考Han et al［12］報道的方法，具體步驟如下：利用多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA樣本，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，將所得產(chǎn)物除去鹽分，轉(zhuǎn)移到384孔板的PCR儀上；采用基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）檢測等位基因，用MassArray Typer軟件分析質(zhì)譜圖［13－14］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用Plink 1.07軟件進(jìn)行分析和質(zhì)控，檢測對照組和病例組數(shù)據(jù)是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，7個標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)的樣本檢測率均需＞90%。比較病例組與對照組7個SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗計算P值、95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）、優(yōu)勢比（odds ratio，OR）以及分析7個標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)的基因型。進(jìn)一步利用Haploview軟件分析7個標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)的單體型。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般資料病例組雙側(cè)睪丸體積均顯著小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 病例組與對照組一般臨床資料（±s）

表2 病例組與對照組一般臨床資料（±s）

項目對照組（n＝368）病例組（n＝361）P值體質(zhì)量指數(shù)（kg／m2）23.01±3.1122.91±2.950.071右側(cè)睪丸體積（ml）14.58±2.658.90±3.510.000左側(cè)睪丸體積（ml）14.51±2.708.95±3.550.000精子濃度（×106／ml）85.84±53.45－－前向運(yùn)動精子（%）56.51±9.99－－

2.2 SPATA22基因SNPs與NOA發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系SPATA22基因的7個標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)的相關(guān)信息及MAF見表3，病例組與對照組間的各MAF分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步分析7個位點(diǎn)的基因型顯示，病例組及對照組各位點(diǎn)基因型的分布差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

2.3 SPATA22基因單體型分析分析7個標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)的單體型，顯示病例組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

3 討論

至少有400種不同的基因參與男性精子發(fā)生過程。這些基因本身的變異或者其表達(dá)產(chǎn)物、功能的改變會影響男性正常精子生成，導(dǎo)致精子發(fā)生障礙［15］。研究［3－7］表明，基因突變或易感性在先天性男性不育中起著重要的作用，一些基因與男性精子發(fā)生障礙密切相關(guān)。減數(shù)分裂是配子形成過程的決定性事件，兩性生殖細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成單倍體配子細(xì)胞，才有胚胎的形成和發(fā)展。如果減數(shù)分裂過程受阻，常常會導(dǎo)致不孕或者非整倍體配子的出現(xiàn)［8］。同源染色體的配對、重組和聯(lián)會是減數(shù)分裂的標(biāo)志。研究［8－9］證明，SPATA22是減數(shù)分裂早期必不可少的關(guān)鍵基因，其突變可導(dǎo)致雄性和雌性生殖細(xì)胞中相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物和蛋白的表達(dá)受限，兩性生殖細(xì)胞的發(fā)育停滯在減數(shù)分裂早期并且逐漸丟失。從而致使減數(shù)分裂時期無法正常聯(lián)會，DNA雙螺旋的斷裂修復(fù)受阻。La Salle et al［8］發(fā)現(xiàn)SPATA22基因調(diào)控的蛋白主要表達(dá)于精母細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)錄物存在于整個睪丸發(fā)育過程中。使用N-乙基-N-亞硝基脲誘導(dǎo)SPATA22基因突變小鼠，顯示雄性及雌性小鼠均出現(xiàn)了不孕不育的表型。雄性突變體小鼠表現(xiàn)為生精障礙以及完全的缺少精子細(xì)胞，突變小鼠減數(shù)分裂過程中染色體不聯(lián)會情況增加，遺傳重組位點(diǎn)減少。研究［9］顯示，在SPATA22基因缺失的突變大鼠中，SPATA22蛋白調(diào)控著DNA斷裂雙鏈上RAD51蛋白參與的DNA修復(fù)過程受阻，其缺失引起了減數(shù)分裂重組的失敗，導(dǎo)致了生精障礙。提示SPATA22基因突變可能與先天性雄性不育的發(fā)生相關(guān)。Aston et al［10］在2010年的一項對歐洲男性人群的全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析中檢測了3個SPATA22基因的SNP位點(diǎn)（rs2291604、rs12602543、rs1488690），發(fā)現(xiàn)其變異可能與嚴(yán)重少精子癥及NOA無關(guān)。但是在其他人群中尚無此研究。

表3 SPATA22基因7個標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)相關(guān)信息及MAF

表4 病例組與對照組SPATA22基因7個標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)基因型分析（%）

表5 SPATA22基因單體型分析（%）

本研究首次檢測中國漢族NOA患者和正常生育對照者SPATA22基因7個標(biāo)簽SNPs（rs1488689、rs1488690、rs2171582、rs7209613、rs2291604、rs17822627、rs9901726）的基因型分布特點(diǎn)，結(jié)果顯示所選取的7個標(biāo)簽SNPs與漢族男性NOA的易感性可能不相關(guān)。進(jìn)一步的基因型及單體型分析也顯示在病例組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與研究［10］結(jié)果相似。推測可能的原因有：①NOA的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，SPATA22基因可能與本組實驗的研究對象的發(fā)病無關(guān)；②本研究中選取的7個標(biāo)簽SNPs可能并沒有覆蓋到SPATA22基因真正易感的SNP位點(diǎn)；③在動物實驗中可以獲得誘導(dǎo)后的突變體，而在人類的研究中很難發(fā)現(xiàn)類似個體。

綜上所述，SPATA22基因7個標(biāo)簽位點(diǎn)的多態(tài)性可能與中國漢族男性NOA的發(fā)生不相關(guān)。SPATA22基因與中國漢族男性NOA發(fā)生的關(guān)系以及發(fā)病中作用機(jī)制仍有待進(jìn)行多中心、大樣本、多種族的人群調(diào)查，以及長期前瞻性研究。可以研究SPATA22基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)的直接測序、SPATA22表觀遺傳學(xué)特點(diǎn)以及深入的功能試驗，進(jìn)一步探索SPATA22在人類精子發(fā)生中的作用。

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Relationship of SPATA22 gene variants with non-obstructive azoospermia in Chinese Han population

Zha Xing1，He Xiaojin1，2，Song Bing1，et al
（1The Reproductive Medicine Center，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，2Biopreservation and Artifical Organs Anhui Provinvial Engineering Research Center，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the relationship of SPATA22 gene polymorphism with the risk of non-obstructive azoospermia（NOA）in Chinese Han population.MethodsA total of 361 cases with idiopathic NOA and 368 males with normal fertility were collected.The genotypes distribution of seven single nucleotide polymorphisms （SNPs）in SPATA22 were detected using Sequenom MassArray technique.Allele frequencies and genotype analysis between the control group and the case group were compared by using Plink 1.07 software.Haplotype analysis was studied by Haploview Software.ResultsBetween the case group and the control group，there was no significant difference in the allele frequencies of the seven SNPs（P＞0.05）and no difference was observed between the case group and the control group in haplotype analysis（P＞0.05）.ConclusionThe seven SNPs of SPATA22 may not be associated with NOA in Chinese Han population.

stertility；non-obstructive azoospermia；SPATA22 gene；single nucleotide polymorphism

R 698.2

A

1000－1492（2015）07－0900－04

2015－03－13接收

國家自然基金（編號：81300538）

安徽醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心、3省部共建重要遺傳病基因資源利用重點(diǎn)實驗室，2安徽省生命資源保存與人工器官工程技術(shù)研究中心，合肥 230022

查 醒，女，碩士研究生；曹云霞，女，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：caoyunxia6＠126.com；杜衛(wèi)東，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：weidongdu＠hotmail.com