李桂芳，汪麗鈺，孫光宇，湯寶林，朱小玉，童 娟，鄭昌成，姚 雯，張 磊，薛 磊，皖 湘，宋闿迪，強 萍，張旭晗，劉會蘭，孫自敏

清髓性不含抗胸腺細(xì)胞球蛋白方案的非血緣臍血移植后免疫重建與巨細(xì)胞病毒感染情況分析

李桂芳，汪麗鈺，孫光宇，湯寶林，朱小玉，童 娟，鄭昌成，姚 雯，張 磊，薛 磊，皖 湘，宋闿迪，強 萍，張旭晗，劉會蘭，孫自敏

目的探討清髓性不含抗胸腺細(xì)胞球蛋白（ATG）方案的非血緣臍血移植（UCBT）后巨細(xì)胞病毒（CMV）感染（血癥）的發(fā)病情況。方法回顧性分析100例接受清髓性不含ATG方案的UCBT患者移植后CMV血癥及CMV病發(fā)生情況，同時初步分析UCBT后受者早期淋巴細(xì)胞重建情況。結(jié)果UCBT后受者外周血CMV拷貝數(shù)＞10／ml發(fā)生率為92.7%，血CMV拷貝數(shù)＞103／m l發(fā)生率為75.3%；中位發(fā)生時間為42 d。CMV病發(fā)生率為1.03%。CMV轉(zhuǎn)陰的中位時間為94 d。UCBT后淋巴細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定上升，中位CD3＋CD8＋T細(xì)胞及CD3＋CD4＋T細(xì)胞分別于移植后2個月及5個月達(dá)正常范圍。結(jié)論清髓性不含ATG方案的UCBT后T細(xì)胞免疫重建相對較快，CMV血癥發(fā)生率高，但CMV病發(fā)生率較低。

巨細(xì)胞病毒感染；臍血移植；預(yù)處理方案；免疫重建

異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）已成為治療惡性血液病、某些遺傳性疾病及先天性免疫缺陷病的有效方法。allo-HSCT后受者均存在免疫缺陷期，因受者淋巴細(xì)胞及其亞群的恢復(fù)在抵御移植后感染特別是病毒和真菌感染方面起決定性作用，因此巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染是移植后最常見的并發(fā)癥之一［1］，其易感因素主要有：接受CMV血清陽性供者的造血干細(xì)胞的CMV血清陰性受者；接受環(huán)孢素、激素等免疫抑制劑治療的患者；接受二次移植的患者［2］。CMV感染可導(dǎo)致CMV間質(zhì)性肺炎、CMV性腸炎、CMV性肝炎等CMV病，若不及時治療，死亡率可達(dá)90%以上［3］，其感染率和發(fā)病率的高低是評價移植預(yù)處理方案優(yōu)劣的良好指標(biāo)。

由于臍血具有移植后嚴(yán)重的移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）發(fā)生率低和移植物抗白血病作用強的優(yōu)勢，非血緣臍血越來越多地用作無同胞人類白細(xì)胞抗原相合供體的患者進行allo-HSCT的移植物供源。臍血移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）后免疫重建（immune reconstitution，IR）特別是T細(xì)胞及其亞群重建明顯延緩，所以早期感染相對死亡率增加。對該研究采用不含抗胸腺細(xì)胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）清髓性方案的UCBT治療惡性血液病100例，探討該方案UCBT后受者CMV的感染和發(fā)病情況，并分析UCBT后受者淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的早期重建情況，初步分析UCBT后早期IR與CMV感染及CMV病發(fā)生的可能內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性分析2012年1月～2014年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血液科行UCBT的100例患者的臨床資料，其中男58例，女42例；年齡1.5～51歲，中位年齡13歲；體重12～90 kg，中位體重45 kg。患者原發(fā)病為慢性粒細(xì)胞白血病5例，急性淋巴細(xì)胞白血病57例，急性髓細(xì)胞白血病31例，急性混合細(xì)胞白血病1例，骨髓增生異常綜合征4例，惡性淋巴瘤2例。進行移植的供受者均在移植前進行CMV抗體（IgG及IgM）檢測，移植前受者血清CMV-IgM均為陰性，CMV-IgG陽性90例，陰性10例；臍血供者血清CMV-IgG及IgM均為陰性。移植前供受者血CMV-DNA均為陰性。

1.2 方法

1.2.1 移植預(yù)處理方案 方案包括：①分次全身照射＋環(huán)磷酰胺＋阿糖胞苷＋重組粒細(xì)胞集落刺激因子，而不加用以免疫抑制為主的藥物ATG，本研究有54例使用該方案；②考慮全身照射有影響生長發(fā)育等毒副作用，對于生長發(fā)育期兒童采用經(jīng)典BUCY2方案聯(lián)合阿糖胞苷或氟達(dá)拉濱的方案，加用氟達(dá)拉濱（22例）或阿糖胞苷（24例）進一步增強抗白血病作用，并增加對受者的免疫抑制而促進植入。

1.2.2 GVHD的預(yù)防 環(huán)孢素A＋霉酚酸酯方案預(yù)防GVHD，環(huán)孢素A移植前1 d始3 mg／（kg· d），持續(xù)24 h靜脈滴注。發(fā)生急性GVHD，維持環(huán)孢素A有效濃度并加用甲基潑尼松龍0.5～2.0 mg／（kg·d）；對肝臟GVHD改環(huán)孢素A為他克莫司口服，根據(jù)GVHD的嚴(yán)重度調(diào)整免疫抑制劑的療程和用量；對于激素難治性GVHD，及時加用巴利昔單抗－舒萊及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等二線免疫抑制藥治療。

1.2.3 CMV感染預(yù)防與監(jiān)測 所有患者于移植后第1天開始給予阿昔洛韋注射液總量10 mg／kg，每日分2次靜注。移植后1個月改為阿昔洛韋口服直至3個月，造血重建后開始每周2次，移植后2～6個月每周1次行血清CMV-DNA檢查，出現(xiàn)血清CMV-DNA拷貝數(shù)＞103／ml給予更昔洛韋或者膦甲酸鈉靜脈滴注，直至CMV-DNA轉(zhuǎn)陰后劑量減半維持治療1～2周。

1.2.4 CMV-DNA的檢測 EDTA抗凝血4℃靜置后吸取上層血清50μl，加等量DNA提取液吹打均勻，100℃保溫10 min，12 000 r／min離心5 min，取上清液為病毒DNA樣本。取DNA樣本5μl，6 000 r／min離心1 min后置于定量PCR儀器的孔樣品槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控參考品梯度（104～108拷貝數(shù)／ml）以及未知標(biāo)本，每批實驗均設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時應(yīng)滿足標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù)r＞0.97和陰性參照無擴增曲線，否則實驗無效。循環(huán)條件：93℃預(yù)變性2min；然后93℃5 s，55℃60 s，先做10個循環(huán)，最后按93℃30 s，55℃45 s，30個循環(huán)結(jié)束。試劑盒（YZB／國0257-2011）購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.2.5 UCBT后T、NK細(xì)胞檢測方法 通過4色流式細(xì)胞術(shù)動態(tài)檢測UCBT后1～6、9、12個月受者T及NK細(xì)胞重建動力學(xué)變化，對移植后不同時間點受者外周血單個核細(xì)胞表面標(biāo)記進行檢測，熒光單克隆抗體標(biāo)記淋巴細(xì)胞亞型包括T淋巴細(xì)胞（CD3＋、CD4＋、CD8＋）和NK細(xì)胞（CD3－CD16＋CD56＋）。用FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀檢測，然后用CellQuest software（BD Biosciences）分析。用淋巴細(xì)胞射門，確定下列細(xì)胞亞型：CD3－CD16＋CD56＋（NK細(xì)胞）、CD3＋（總T細(xì)胞）、CD3＋CD4＋（輔助T細(xì)胞）、CD3＋CD8＋（細(xì)胞毒T細(xì)胞）亞型。每個亞型根據(jù)光散射和前側(cè)向散射的特征及以上單克隆抗體識別的表面抗原的表達(dá)來分析。

1.2.6 UCBT后CMV血癥和CMV病的診斷 根據(jù)臨床表現(xiàn)可將CMV感染分為CMV血癥和CMV病，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考Xuan et al［4］研究，CMV血癥：有CMV病原學(xué)證據(jù)［CMV-DNA檢測陽性和（或）CMV血清學(xué)顯示CMV-IgG、IgM均陽性］但無CMV感染癥狀；CMV?。翰幻髟虬l(fā)熱，伴或不伴白細(xì)胞總數(shù)下降50%，有CMV病原學(xué)證據(jù)及病毒損害臟器的組織病理學(xué)證據(jù)，如出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎、胃腸炎、肝炎、視網(wǎng)膜炎等器官、組織損害，需免疫組織化學(xué)證實或者組織活檢病理證實并排除其他病因。本研究中定義血CMV-DNA陽性，無論拷貝數(shù)多少，即為CMV感染發(fā)生。

2 結(jié)果

2.1 UCBT后造血重建及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的恢復(fù)情況UCBT后中位隨訪時間為18.5個月（4～33個月），其中隨訪12個月以上者46例。100例患者中，未植入3例，存活78例，中性粒細(xì)胞植入時間11～38 d，中位時間為19 d，血小板植入時間為16～192 d，中位時間為37 d。移植后1個月受者單核細(xì)胞絕對數(shù)（absolute monocyte count，AMC）及淋巴細(xì)胞絕對數(shù)（absolute lymphocyte count，ALC）開始快速持續(xù)升高，中位AMC于UCBT后1個月達(dá)正常范圍，AMC于UCBT后4～18個月均維持在較高水平；中位ALC于UCBT后2個月達(dá)正常范圍，以后穩(wěn)定持續(xù)升高，見圖1。

2.2 UCBT后NK細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的重建淋巴細(xì)胞中最快速重建的是NK細(xì)胞，其中位絕對數(shù)于UCBT后1個月達(dá)正常范圍。T淋巴細(xì)胞亞群在UCBT后也一直呈上升趨勢，CD3＋CD8＋T細(xì)胞上升最快，UCBT后2個月達(dá)正常范圍，4～12個月高于正常值上限，以后輕度回落到正常值范圍。CD3＋T細(xì)胞于UCBT后3個月達(dá)正常范圍，6～12個月略高于正常值上限。CD3＋CD4＋T細(xì)胞于UCBT后5個月達(dá)正常范圍，見圖2。

2.3 CMV血癥及CM V病發(fā)生率對97例獲得造血重建的患者進行回顧性分析顯示：90例（92.8%）發(fā)生CMV血癥（血清CMV-DNA拷貝數(shù)＞10／ml），其中UCBT后第1個月內(nèi)CMV-DNA拷貝數(shù)＞10／ml者有39例（40.2%），CMV-DNA拷貝數(shù)＞103／ml者有8例（8.2%）；最早發(fā)生CMV血癥的時間為回輸后17 d，移植后60 d內(nèi)CMV-DNA拷貝數(shù)＞10／ml者有73例（75.3%），CMV-DNA拷貝數(shù)＞103／ml者有49例（50.5%）；移植后90 d內(nèi)CMV-DNA拷貝數(shù)＞10／ml者有50例（51.5%），CMV-DNA拷貝數(shù)＞103／ml者有12例（12.4%）；移植后120 d內(nèi)CMV-DNA拷貝數(shù)＞10／m l者有23例（23.7%），CMV-DNA拷貝數(shù)＞103／m l者有4例（4.1%）?；剌斈氀杉?xì)胞后3個月內(nèi)CMV未感染者8例（8.2%），有1例明確診斷為CMV腦炎，腦脊液CMV-DNA陽性，抗病毒治療后有效，其他UCBT后發(fā)生肝損害、腸炎及肺炎等病例均未能明確診斷與CMV感染有關(guān)。

患者外周血CMV-DNA拷貝數(shù)＞10／ml的時間為17～109 d，中位時間為32 d，發(fā)生率為92.8%；患者外周血CMV-DNA拷貝數(shù)＞103／m l的時間為19～181 d，中位時間為42 d，發(fā)生率為75.3%；經(jīng)過抗病毒治療后，患者外周血CMV轉(zhuǎn)陰的時間為34～226 d，中位時間為94 d，其中CMV轉(zhuǎn)陰時間超過120 d的患者均因發(fā)生GVHD而處于免疫抑制治療中?；颊逤MV累積再激活率曲線顯示，自移植后20 d開始出現(xiàn)感染，并呈逐漸上升趨勢，到移植后40～80 d曲線上升速度最快，之后逐漸變慢，120 d之后曲線將近平緩，見圖3。為分析移植后CD3＋CD8＋細(xì)胞毒T細(xì)胞的重建速度與血CMV感染發(fā)生率的關(guān)系，考慮到CMV感染發(fā)生的中位時間在移植后42 d，故分析移植后1個月外周血CD3＋CD8＋細(xì)胞毒T細(xì)胞數(shù)與CMV感染發(fā)生的關(guān)系顯示：移植后1個月CD3＋CD8＋T細(xì)胞的中位數(shù)作為界點（中位CD3＋CD8＋T細(xì)胞數(shù)為172／μl），將細(xì)胞數(shù)高于172／μl的患者與低于172／μl的患者CMV感染發(fā)生率進行比較，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.98）。

3 討論

CMV感染及CMV病是造血干細(xì)胞移植患者術(shù)后最常見的機會性感染和最嚴(yán)重的移植并發(fā)癥之一；據(jù)報道［5］，在移植后的第1年里，超過50%的受者會有CMV原發(fā)感染或再激活的實驗室證據(jù)。本研究針對不含ATG的清髓性預(yù)處理的UCBT后患者的資料分析，顯示移植后患者CMV感染發(fā)生率高達(dá)92.8%（移植前血CMV-DNA陰性，移植后血CMV-DNA陽性），血CMV-DNA＞103拷貝數(shù)／ml發(fā)生率也高達(dá)75.3%，與研究［6］相似。研究［7］顯示，CMV感染在兒童中的發(fā)生率為91.7%，而CMV病發(fā)生率為19%，CMV病發(fā)生率明顯高于本研究。UCBT后高發(fā)生的CMV感染的可能原因主要有：①UCBT供者CMV血清學(xué)抗體均為陰性，而受者幾乎均為CMV血清學(xué)陽性；②輸注的UCBT中所含T淋巴細(xì)胞少且表型為初始（na?ve）型，移植物中缺少抗CMV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞（cytotoxic lymphayte，CTL）；③包含ATG的預(yù)處理方案進一步延緩了UCBT后IR。另外，清髓性預(yù)處理也可能延緩早期IR，增加CMV及EB病毒等感染率［4］。

研究［1，8－9］報道移植前供受者血清學(xué)狀態(tài)是移植后發(fā)生CMV感染的主要危險因素，供者CMV-IgG陰性，受者CMV-IgG陽性者CMV再激活率最高，死亡率也最高。最近研究［10］證實在清髓性預(yù)處理方案的非血緣allo-HSCT后，CMV血清學(xué)陽性受者接受CMV血清學(xué)陽性供者（與CMV陰性供者相比較）移植物可改進總生存率，而CMV血清學(xué)陰性受者接受CMV血清學(xué)陽性供者移植物可降低生存率。本研究由于臍血供體CMV血清學(xué)均為陰性，而移植受者血清學(xué)陽性率高達(dá)90%，所以UCBT后受者CMV再激活可能是CMV感染的一個主要原因。

移植物中所含有的CMV特異性CTL以及移植后由CMV抗原刺激和細(xì)胞因子驅(qū)動的na?ve T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成的CMV特異性CTL是清髓性allo-HSCT后控制CMV感染的主要免疫細(xì)胞。采用人類白細(xì)胞抗原相合同胞供體移植時，當(dāng)患者和供者allo-HSCT前CMV抗體均陽性，CMV-CTL的恢復(fù)快速，可達(dá)到所有CD8＋T細(xì)胞的21%；若供受者CMV抗體均為陰性，則CMV特異性CTL早期重建發(fā)生時間延遲。接受非血緣移植的患者與同胞移植患者比較，CMVCTL恢復(fù)推遲，allo-HSCT后100 d內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)CMV-CTL產(chǎn)生［11－12］，由此可以推測UCBT后CMV發(fā)生率高可能與CMV-CTL重建延遲有關(guān)。研究［13］顯示盡管UCBT物中基本不含有CMV特異性CTL，但在UCBT后8周受者外周血中就能檢測到CMV特異性CTL，考慮為臍血na?ve T細(xì)胞在抗原刺激和細(xì)胞因子驅(qū)動下可轉(zhuǎn)變成CMV特異性CTL。然而這些CMV特異性CTL細(xì)胞的數(shù)量很有限、功能仍不完善，不能完全清除CMV血癥，受者只有在CD4＋CD45RA＋T細(xì)胞恢復(fù)后才能完全清除CMV血癥，這可能是由于本研究采用了含ATG的預(yù)處理方案，由于ATG較長的半衰期，抑制了移植后na?ve T細(xì)胞的外周擴增，進一步延緩了UCBT后T細(xì)胞重建。因為含ATG的方案的UCBT受者移植后T細(xì)胞包括CMV特異性CTL重建延緩，故含ATG方案的UCBT后CMV病發(fā)病率相對增高［13－14］。

本研究顯示CMV病發(fā)生率相對偏低，考慮與本中心采用了不含ATG的預(yù)處理方案有關(guān)，該方案UCBT后總淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及NK細(xì)胞重建速度均較快，中位NK細(xì)胞絕對數(shù)于移植后1個月內(nèi)即可達(dá)正常水平。本研究分析移植后1個月CD3＋CD8＋T細(xì)胞數(shù)與CMV感染發(fā)生的關(guān)系表明，UCBT后1個月CD3＋CD8＋T細(xì)胞數(shù)與CMV感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但未檢測CMV特異性CTL，可能是因為總CD3＋CD8＋T細(xì)胞數(shù)的重建不能完全反應(yīng)CMV特異性CTL的重建。本研究組前期研究［15］顯示UCBT 4個月后受者外周血終末分化效應(yīng)記憶T細(xì)胞比例明顯升高，也提示UCBT后T細(xì)胞在發(fā)揮著抗感染等效應(yīng)功能。另外UCBT后密切監(jiān)測CMV再激活，及時干預(yù)治療也是降低CMV病的一個主要因素。由于本研究對UCBT后發(fā)生肺炎、腸炎、肝炎等的病例未行脫落細(xì)胞及組織學(xué)相關(guān)CMV抗原檢測，也可能導(dǎo)致統(tǒng)計的CMV病發(fā)生率偏低。

由于UCBT獨特的特征（CMV血清學(xué)陰性、na?ve T細(xì)胞），UCBT后CMV感染及CMV病的發(fā)生高是影響UCBT成功的關(guān)鍵因素之一。在目前臨床上尚不能進行CMV特異性T細(xì)胞輸注的情況下，通過改進移植方案來加快UCBT后IR特別是CMV特異性T細(xì)胞的恢復(fù)是降低CMV病的一個重要措施，而采用不含ATG的方案是加快UCBT后IR的主要方法。本研究采用不含ATG的方案加快了UCBT后IR，UCBT后半年內(nèi)密切監(jiān)測CMV-DNA、及時進行干預(yù)治療，也是降低UCBT患者CMV發(fā)生率的重要措施。

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Analysis of immune reconstitution and the incidence of cytomegalovirus infection after unrelated cord blood transp lantation follow ing m yeloablative conditioning w ithout antithym ocyte globulin

Li Guifang，Wang Liyu，Sun Guangyu，et al
（Dept of Hematology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To investigate the incidence of cytomegalovirus infection after unrelated cord blood transplantation（UCBT）following myeloablative conditioning without antithymocyte globulin（ATG）.MethodsThe data of100 patients，who underwent UCBT，were collected，and the incidences of CMV infection and CMV disease，as well as primary lymphocytes reconstitution were analyzed retrospectly.ResultsThe incidence of plasma CMV-DNA copies＞10／ml and＞103／ml in peripheral blood（PB）of patients after UCBT were 92.7%and 75.3%，respectively.Themedian time of plasma CMV-DNA copies＞103／m l in PB of patients after UCBTwas42 days.The incidence of CMV disease was1.03%.Themedian time for CMV clearance was 94 days.Lymphocytes counts steadily increased after UCBT and themedian count of CD3＋CD8＋T cells and CD3＋CD4＋T cells reached the normal level atmonth 2 and 5 after UCBT respectively.ConclusionThe immune reconstitution of T cell subset is relatively fastafter UCBT followingmyeloablative conditioning without ATG and the incidence of CMV viremia is high，but the incidence of CMV disease is low after this UCBT protocal.

cytomegalovirus infection；unrelated cord blood transplantation；conditioning regimen；immune reconstitution

R 512.93

A

1000－1492（2015）08－1128－05

2015－03－16接收

安徽省科技廳年度科研項目（編號：1301043028）；安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研課題（編號：13zc018）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血液科，合肥 230001

李桂芳，女，碩士研究生；

劉會蘭，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：liuhuilan＠m(xù)edmail.com.cn