陳阿娜 葉生梅 孟娜 劉艷

摘 要：采用大腸桿菌作為表達宿主進行蛋白質(zhì)異源表達的研究逐漸增多，然而實驗過程中存在2個突出問題：（1）可溶性表達量低;（2）胞外分泌能效差。該文系統(tǒng)地綜述了當前的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，內(nèi)容涉及外源蛋白在大腸桿菌中高效可溶性表達策略及胞外分泌策略，并對實驗中存在的問題和和研究趨勢提出了見解。部分策略已用于實驗教學并取得了良好的教學效果。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌;可溶性表達;胞外分泌;研究趨勢

中圖分類號 R394.8文獻標識碼 A ?文章編號 1007-7731（2015）13-25-03

Advances of Soluble and Extracellular Overexpression of Heterologous Proteins in Escherichia coli

Chen Ana et al.

（School of Biochemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

Abstract：Heterologous proteins expression in E.coli has been gradually increased in recent years. However，there are two outstanding issues during the experiment（1）low soluble expression level;（2）poor secretion efficiency. This paper systematically reviews the currentresearch status，which relates strategies of soluble expression，extracellular secretion，experimental problems in E.coli，and puts forward opinions of research trends. Some of the strategies have been used in experimental teaching and achieved good teaching results.

Key words：E.coli;Soluble expression;Extracellular secretion;Research trends

采用野生型菌種發(fā)酵生產(chǎn)目標蛋白的效率較低，通過基因工程技術(shù)進行異源高效表達是降低生產(chǎn)成本的有效途徑。常用的宿主菌為大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，也有在畢赤酵母中表達的報道。與其他宿主菌相比，大腸桿菌具有3個顯著優(yōu)勢：細胞生長快速、分子操作簡單和能在廉價培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)，使其成為科研、生產(chǎn)中最常用的原核表達宿主[1]。但是我們并不回避外源基因在大腸桿菌中表達時存在的2個突出問題：（1）可溶性表達量低;（2）胞外分泌能效差[2]。近年來研究者嘗試了多種策略提高可溶性表達量和分泌效率，研究主要集中在調(diào)控發(fā)酵過程參數(shù)，優(yōu)化培養(yǎng)基等措施上，對外源蛋白自身改造的研究相對較少。

1 研究現(xiàn)狀

外源蛋白在大腸桿菌中的表達調(diào)節(jié)是一個包括諸多元素的復(fù)雜系統(tǒng)，并非每一種蛋白都能在大腸桿菌中高效表達，部分蛋白無法表達[3]。由于大腸桿菌分泌系統(tǒng)的組成元件復(fù)雜、調(diào)控精細以及固有的雙層膜結(jié)構(gòu)，因此大腸桿菌表達系統(tǒng)的分泌性能較差[4]。筆者對當前外源蛋白在大腸桿菌中過量可溶性表達策略和高效分泌策略概括如下。內(nèi)容涉及質(zhì)粒改造、宿主菌改造、底物蛋白改造、發(fā)酵過程參數(shù)調(diào)控及培養(yǎng)基優(yōu)化等方面。

1.1 質(zhì)粒和宿主的有效改造和組合 通過對質(zhì)粒元件的合理構(gòu)建，可在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上調(diào)節(jié)蛋白合成。如在指導(dǎo)學生采用大腸桿菌表達人源化治療性抗體片段時，對pAVEwayTM質(zhì)粒進行操縱子雙回文結(jié)構(gòu)改造和啟動子替換，使得外源蛋白的表達量顯著提升（數(shù)據(jù)還未發(fā)表）;Olins等從T7噬菌體基因前導(dǎo)序列中鑒定了—9bp的序列g(shù)10-L，該序列能使多種基因的表達水平提高40～340倍。若將其置于合成SD序列的上游，按照β-半乳糖苷酶的活性與LacZ mRNA的水平來估計，g10-L序列能使LacZ的翻譯水平提高110倍[5]。大腸桿菌II型分泌系統(tǒng)中蛋白跨外膜分泌主要依靠非特異性滲漏，效率較低，可通過構(gòu)建外膜滲漏型突變株以提高蛋白胞外分泌水平。如Gumpert等構(gòu)建了缺少細胞壁和周質(zhì)空間的L-型菌株用于青霉素G?；D(zhuǎn)移酶、葡萄球菌激酶和微小抗體的制備[6]。Ni等構(gòu)建了敲除外膜脂蛋白的突變株，使麥芽糖結(jié)合蛋白、木聚糖酶和纖維素酶的胞外分泌比例達到總表達量的90%以上[7]。早期的研究多集中在此領(lǐng)域，并且已有和將有許多優(yōu)良的商業(yè)化質(zhì)粒和宿主可供選用。當前的研究普遍采用“試錯法”，即直接采用商業(yè)化的質(zhì)粒和大腸桿菌變種，構(gòu)建合適的表達系統(tǒng)。

1.2 優(yōu)化信號肽 江南大學吳敬團隊研究發(fā)現(xiàn)不同的翻譯起始區(qū)氨基酸序列和pelB信號肽切割位點的數(shù)量會影響外源蛋白翻譯和折疊效率，繼而影響跨膜分泌過程，通過增加信號肽切割位點數(shù)量和隨機突變翻譯起始區(qū)氨基酸序列，獲得基質(zhì)分泌能力顯著提升的突變體[8]。亦有研究表明適當增加II型分泌系統(tǒng)信號肽N端帶電區(qū)域的正電荷或疏水區(qū)域的疏水性有利于提高前體蛋白的分泌效率[9]，但目前并無如何根據(jù)指定的目標蛋白選擇合適的信號肽進行分泌表達的通用規(guī)則。

1.3 融合表達和共表達分子伴侶 多種融合蛋白，如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）以及硫氧還蛋白（Trx）等均已被證實能成功地表達折疊正確、有生物活性的蛋白，能明顯提高在大腸桿菌細胞質(zhì)中的可溶性，減少包涵體的形成。分子伴侶是細胞中一大類蛋白質(zhì)，在細胞內(nèi)幫助其他蛋白完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構(gòu)成這些蛋白結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能時的組份。采用分子伴侶在大腸桿菌中進行外源蛋白高效表達成為近年來的研究熱點，如通過共表達鐮狀瘧疾蟲分子伴侶增強了抗瘧疾藥物靶標環(huán)化水解酶的表達量[10]。

1.4 共表達或改造轉(zhuǎn)運蛋白 在大腸桿菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)中，外源蛋白通過Sec或Tat途徑進入周質(zhì)空間，再通過約12～16種蛋白質(zhì)組成的外膜通道分泌至胞外。然而，由于轉(zhuǎn)運蛋白的天然表達量低，轉(zhuǎn)運效率有限，使得外源蛋白在大腸桿菌中分泌效能低?？赏ㄟ^共表達或改造參與跨膜轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)運蛋白或輔助蛋白以改善轉(zhuǎn)運通路進而提高蛋白分泌水平[11]。如Miksch等將大腸桿菌素釋放基因與β-葡聚糖酶共表達時，大腸桿菌的外膜通透性明顯增加，使得大量原本定位在周質(zhì)空間中的β-葡聚糖酶釋放至胞外培養(yǎng)基中[12]。Sugamata等針對I型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運蛋白HlyB和HlyD進行定向改造，獲得了使枯草芽孢桿菌蛋白酶E胞外分泌量提高27倍的突變體[13]。

1.5 外源蛋白自身的改造 一種簡單的方式是優(yōu)化蛋白編碼基因密碼子。在實際應(yīng)用中，可通過全基因合成優(yōu)化密碼子、穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)[14]。另一種方式是通過蛋白質(zhì)工程改造既定蛋白。近年來采用蛋白質(zhì)工程改造目標蛋白，提高其在大腸桿菌中的分泌效率方面取得了一定進展。如杰能科公司2011年將脫支芽孢桿菌普魯蘭酶N端處104個氨基酸截短后，發(fā)現(xiàn)截短體比全長蛋白具有更高的胞外分泌能力。專利發(fā)明人推測這種現(xiàn)象可能與重組酶分子量的減小有關(guān)[15]。最新的研究報道通過在蛋白質(zhì)N端添加連續(xù)的5個天冬氨酸，使得南極假絲酵母脂肪酶B在大腸桿菌中的胞外分泌量達到1.9g/L。添加的5個天冬氨酸使脂肪酶B二聚體的四級結(jié)構(gòu)發(fā)生翻轉(zhuǎn)，新的二聚體結(jié)構(gòu)可能形成某種結(jié)構(gòu)信號肽與GSP（General secretion pathway）上的特定通道蛋白相互識別，促使目標蛋白分泌至胞外[1]。

1.6 發(fā)酵過程參數(shù)控制和培養(yǎng)基優(yōu)化 該方式是一種簡單的提高外源蛋白表達量和分泌量的常用策略，因過程和原理相對簡單，使用較為普遍。如陳文波等通過分階段調(diào)控發(fā)酵過程溫度，使得目標蛋白在大腸桿菌中的表達量和分泌量均有大幅提升[16]。通過添加表面活性劑、滲透劑、金屬離子和甘氨酸等培養(yǎng)基添加劑能夠提高細胞膜的通透性，有助于加強蛋白分泌。如聶堯等通過在發(fā)酵后期再培養(yǎng)基中添加0.6%的甘氨酸，可使90%以上的目標蛋白分泌至胞外[17]。此外還可通過優(yōu)化培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，調(diào)控細胞培養(yǎng)的溫度、pH和溶氧等環(huán)境參數(shù)，獲得有利于細胞生長和蛋白胞外分泌的發(fā)酵策略。

2 存在的問題和研究趨勢

綜上所述，在提高大腸桿菌外源蛋白表達及分泌水平研究中，以往焦點主要集中在表達系統(tǒng)和工藝水平上，但是幾乎所有成功案例都具有蛋白特異性。盡管目前在強化大腸桿菌分泌重組蛋白的效能方面取得了一定的進展，但其普遍適用性和有效性并不樂觀，重組蛋白在大腸桿菌中的高效胞外分泌型表達仍然是一個技術(shù)難點。通過數(shù)據(jù)庫對比研究發(fā)現(xiàn)，采用完全相同的表達系統(tǒng)和發(fā)酵工藝表達不同的外源蛋白時，表達量和分泌效率往往有數(shù)量級上的差距。據(jù)此推測外源蛋白本身一級氨基酸序列至三級空間結(jié)構(gòu)甚至四級結(jié)構(gòu)也是影響表達水平的重要因素，通過蛋白質(zhì)工程改造既定蛋白可能是實現(xiàn)高效表達和分泌有效途徑。

參考文獻

[1]Kim SK，Park YC，Lee HH，et al. Simple amino acid tags improve both expression and secretion of Candida antarctica lipase B in recombinant Escherichia coli[J].Biotechnology and bioengineering，2015，112：346-55.

[2]Zouari Ayadi D，Ben Ali M，Jemli S，et al. Heterologous expression，secretion and characterization of the Geobacillus thermoleovorans US105 type I pullulanase[J].Applied microbiology and biotechnology，2008，78：473-81.

[3]Chen A，Li Y，Liu X，et al.Soluble expression of pullulanase from Bacillus acidopullulyticus in Escherichia coli by tightly controlling basal expression[J].Journal of industrial microbiology & biotechnology，2014，41：1803-10.

[4]Ni Y，Chen R.Extracellular recombinant protein production from Escherichia coli[J].Biotechnology letters，2009，31：1661-70.

[5]Olins PO，Rangwala SH.A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli[J].The Journal of biological chemistry，1989，264：16973-6.

[6]Kujau MJ，Hoischen C，Riesenberg D，et al. Expression and secretion of functional miniantibodies McPC603scFvDhlx in cell-wall-less L-form strains of Proteus mirabilis and Escherichia coli：A comparison of the synthesis capacities of L-form strains with an E-coli producer strain[J].Applied microbiology and biotechnology，1998，49：51-8.

[7]Shin HD，Chen RR. Extracellular Recombinant Protein Production From an Escherichia coli lpp Deletion Mutant[J]. Biotechnology and bioengineering. 2008;101：1288-96.

[8]Chen S，Liu ZG，Chen J，Wu J. Study on Improvement of Extracellular Production of Recombinant Thermobifida fusca Cutinase by Escherichia coli[J].Applied biochemistry and Biotechnology，2011，165：666-75.

[9]Hikita C，Mizushima S. Effects of total hydrophobicity and length of the hydrophobic domain of a signal peptide on in vitro translocation efficiency[J].The Journal of biological chemistry，1992，267：4882-8.

[10]Stephens LL，Shonhai A，Blatch GL. Co-expression of the Plasmodium falciparum molecular chaperone，PfHsp70，improves the heterologous production of the antimalarial drug target GTP cyclohydrolase I，PfGCHI[J].Protein expression and purification，2011，77：159-65.

[11]Low KO，Mahadi NM，Rahim RA，et al. Enhanced secretory production of hemolysin-mediated cyclodextrin glucanotransferase in Escherichia coli by random mutagenesis of the ABC transporter system[J].Journal of biotechnology，2010，150：453-9.

[12]Miksch G，Kleist S，F(xiàn)riehs K，et al.Overexpression of the phytase from Escherichia coli and its extracellular production in bioreactors[J].Applied microbiology and biotechnology，2002，59：685-94.

[13]Sugamata Y，Shiba T. Improved secretory production of recombinant proteins by random mutagenesis of hlyB，an alpha-hemolysin transporter from Escherichia coli[J].Applied and environmental microbiology，2005，71：656-62.

[14]Song HF，Li GH，Mai WJ，et al.Codon Optimization EnhancesProtein Expression of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus DNA Polymerase in E-coli[J].Currentmicrobiology，2014，68：293-300.

[15]Svendsen A. Pullulanase variants and methods for preparing such variants with predetermined properties[P].US patent 006838257B2，2005.

[16]Chen WB，Nie Y，Xu Y，et al R. Enhancement of extracellular pullulanase production from recombinant Escherichia coli by combined strategy involving auto-induction and temperature control[J].Bioprocess and biosystems engineering，2014，37：601-8.

[17]Nie Y，Yan W，Xu Y，et al. High-level expression of Bacillus naganoensis pullulanase from recombinant Escherichia coli with auto-induction：effect of lac operator[J].PloS one，2013，8：e78416.

（責編：張長青）