耿海東 金洪梅 張延君 張小林 張佳潔 李 祥 周長宇 丁圓英 高光雨 王卓樂 喬丹 李吟雪 翟熙文 華育平 張國鋼 柴洪亮

摘要 [目的]了解江西遂川地區(qū)野生鷺科鳥類攜帶禽流感和新城疫病毒的感染情況。[方法] 于2014年10月在江西省遂川地區(qū)采集鷺科鳥類的肛拭子110份、咽拭子110份，采用SPF雞胚進行病毒分離，通過血凝試驗篩選出疑似陽性樣品，然后再用RT-PCR進行鑒定。[結果] 在110份被檢樣品中，除4份樣品外，其余樣品的血凝效價均為0。經(jīng)RT-PCR檢測，所有樣品禽流感和新城疫病毒檢測結果均呈陰性。這表明2014年秋季江西遂川地區(qū)野生鷺科鳥類發(fā)生禽流感和新城疫病毒感染的風險較小。[結論] 該研究可為了解江西各地區(qū)野生水禽禽流感和新城疫的感染情況提供基礎數(shù)據(jù)。

關鍵詞 禽流感；新城疫；監(jiān)測

中圖分類號 S855 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）27-129-02

Monitoring of Avian Influenza and Newcastle Disease Virus in Suichuan Region of Jiangxi Province

GENG Hai-dong1，2， JIN Hong-mei1， ZHANG Yan-jun3， ZHANG Guo-gang4*， CHAI Hong-liang1* et al

（1.College of Wildlife Resources， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. General Monitoring Station for Wildlife-borne Infectious Diseases，State Forestry Administration，Shenyang， Liaoning 110034； 3. Qinghuangdao Center for Wildlife Rescue and Protection， China Wildlife Conservation Association， Qinghuangdao， Hebei 066100； 4. National Bird Tagging Center， Research Institute of Forest Ecology， Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry， Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration， Beijing 100091）

Abstract [Objective] The research aimed to investigate the epidemiological characteristics of avian Influenza and newcastle disease virus of wild Ardeid birds in Suichuan Region of Jiangxi Province. [Method] 110 oropharyngeal and 110 cloacal swabs of Ardeid birds were collected from Suichuan Region of Jiangxi Province in October of 2014. The viruses were separated by using SPF chicken embryos and suspected positive samples were screened out by hemagglutination test and identified by RT-PCR. [Result] Among 110 detected samples，hemagglutination titer of other samples was 0 except 4 samples. The detection results of RT-PCR showed that the detection samples of avian Influenza and newcastle disease virus of all samples were negative. This indicated that the infection risk of avian Influenza and newcastle disease of Ardeid birds in Suichuan Region of Jiangxi Province in the summer of 2014 was small. [Conclusion] The research could provide basic data for understanding the infection situations of avian Influenza and newcastle disease of wild water birds in each region of Jiangxi Province.

Key words Avian influenza； Newcastle disease； Monitoring

新城疫（Newcastle disease，ND），也稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的以禽類消化道、呼吸道損傷為主要特征的一種急性、高度接觸性、烈性傳染病，常呈敗血癥經(jīng)過。雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等多種家禽及野禽均易感染，人類也可以感染此病毒[1]?？梢砸鹨赘须u群呼吸困難、甩頭、流涎、神經(jīng)紊亂、產蛋率下降等癥狀以及氣管出血、腺胃乳頭出血、腸道淋巴結組織有棗核狀潰瘍灶等病理變化[2-3]。該病流行于世界各國，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重危害和威脅世界的養(yǎng)禽業(yè)，被世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）列為 A 類疫病，我國將其列為一類動物疫病。目前，新城疫已成為嚴重危害我國養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了嚴重損失。

禽流感（Avian influenza，AI）又稱歐洲雞瘟或者真性雞瘟，是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的以感染禽類為主的高度接觸性傳染病，均屬于A型流感病毒[4-5]。按照病原體類型的不同，禽流感可分為高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大類。其中，高致病性禽流感被國際獸醫(yī)局（OIE）定性為A類烈性傳染病，我國農業(yè)部也將其列為甲類監(jiān)測傳染病，而且被列入國際生物武器公約動物源傳染病名單[6-7]。禽流感的每次爆發(fā)都帶來了極其巨大的經(jīng)濟損失，嚴重危害了世界各國禽類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。據(jù)報道，2005年12月15日江西省遂川縣曾發(fā)生H5N1亞型高致病性禽流感疫情。

江西遂川縣泉江鎮(zhèn)上溪村某農戶飼養(yǎng)的鴨出現(xiàn)死亡，共死亡鴨1 640只，而這一疫情帶來的相繼撲殺工作給當?shù)厝嗽斐闪藝乐氐慕?jīng)濟損失。2013年12月江西省出現(xiàn)了人感染H10N8的病例。因此，對江西遂川地區(qū)野鳥攜帶和感染禽流感病毒和新城疫病毒的調查就顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

SPF雞胚。SPF雞胚，購自維科生物技術開發(fā)公司。

1.1.2

主要試劑。

Trizol，購自Invitrogen公司；M-MLV反轉錄酶，購自PROMEGA公司；Taq酶與dNTP，購自GenStar公司；RRI，購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1

樣品來源。

在江西遂川地區(qū)主要采用活捕法（包括網(wǎng)捕法和籠捕法）捕捉到110只野生鷺科鳥類。每只鷺都采集咽拭子和肛拭子樣品，樣品共220份。置于拭子病毒保存液中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2

病毒的分離。

采用雞胚尿囊腔接種法進行病毒增殖。同一樣品編號的處理后的咽拭子、肛拭子保存液上清各取0.1 ml，混合接種于9～11日齡SPF雞胚尿囊腔，每個樣品接種1枚SPF雞胚，37 ℃全自動孵化器內孵育72 h，每隔12 h照胚觀察1次。棄去24 h以內的死亡雞胚，無菌環(huán)境下收獲24～72 h內的死胚及活胚的尿囊液。所有樣品經(jīng)過雞胚傳代3次后，對收集的尿囊液進行血凝（HA）試驗，測定血凝效價，并對HA陽性樣品進行AIV和NDV的RT-PCR檢測。

1.2.3

病毒RNA的提取。

①取200 μl HA陽性樣品的尿囊夜于離心管中，加入600 μl裂解液，混合振蕩90 s；②靜置5 min后加入200 μl三氯甲烷，混勻振蕩，靜置2 min后12 000 r/min 4 ℃離心10 min；③取450 μl上清液于新的離心管中，加入450 μl異丙醇，混勻，室溫沉降10 min，12 000 r/min 4 ℃下離心10 min；④棄上清，加入1 000 μl 75%酒精，12 000 r/min 4 ℃下離心10 min；⑤棄上清，干燥沉淀，加10 μl DEPC水進行溶解；⑥加2 μl反轉錄引物，70 ℃水浴5 min，冰上冷卻5 min。⑦加入M-MLV反轉錄酶0.5 μl，RNA酶抑制劑05 μl，DEPC水3 μl，2.5 mmol/L的dNTP 4 μl和5×buffer 5 μl后進行反轉錄。⑧反轉錄后的核酸存放于-20 ℃條件下。

1.2.4

RT-PCR檢測。

在PCR管中依次加入10×Buffer 2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，上、下游引物各1 μl（20 pmol/μl），Taq DNA聚合酶0.5 μl，反轉錄產物1.5 μl，補雙蒸水至25 μl進行PCR（每個血凝陽性樣品都要檢測禽流感和新城疫病毒）。RT-PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s、退火溫度下30 s、72 ℃30 s，30個循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。其中，AIV的退火溫度為50 ℃，NDV的退火溫度為531 ℃。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。

2 結果與分析

2.1 血凝效價

對采集的尿囊液進行血凝試驗。由表1可知，在110份被檢樣品中有4份有血凝試驗結果呈陽性，其余血凝效價均為0。

2.2 RT-PCR檢測結果

提取尿囊液中的病毒核酸為模板，使用自己設計的AIV鑒定引物和NDV鑒定引物分別進行PCR擴增。從圖1～2可以看出，AIV陽性對照樣品的目的片段大小為960 bp，NDV陽性對照樣品的目的片段大小為375 bp。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，發(fā)現(xiàn)AIV陽性對照樣品出現(xiàn)960 bp的目的片段，NDV陽性對照樣品出現(xiàn)375 bp的目的片段，待檢的血凝陽性樣品未出現(xiàn)相應的目的片段。由此可見，待檢的血凝樣品的AIV和NDV檢測結果均為陰性。

3 討論

新城疫在世界范圍內曾有過3次大流行。目前，該病在我國各地普遍存在，并且是我國養(yǎng)禽業(yè)危害最大、經(jīng)濟損失最嚴重的禽病之一[8] 。禽流感也是嚴重危害和威脅我國乃至全世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的A類疫病，每次暴發(fā)都會給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。江西省遂川縣被稱為“遂川鳥道”，是全國三大候鳥遷徙通道之一，是我國華中地區(qū)遷徙鳥類的必經(jīng)“隘口”，是遷徙鳥類往返俄羅斯、我國北方地區(qū)與東南亞，乃至澳大利亞和新西蘭等路線上的關鍵點之一。候鳥在遷徙活動中，存在于候鳥體內的禽流感病毒或新城疫病毒將有可能在遷徙過程中進行傳播。候鳥群中存在的呈低致病性的禽流感病毒有可能通過家禽與野生鳥類接觸，傳染給家禽，在家禽中重組和變異，導致高致病性禽流感（ HPAI）病毒的產生。自1959 年以來，在世界范圍內這種由野生鳥類中的

LPAI 傳染給家禽，在家禽中變異成為HPAI，最終導致疫情的多次暴發(fā)[9]。由此可見，對這個地區(qū)禽流感和新城疫病毒的監(jiān)測將有利于預測與此通道相關地區(qū)疫情的暴發(fā)情況。

筆者對江西省遂川地區(qū)野生鷺科鳥類進行了樣品采集，對這批樣品禽流感和新城疫病毒的鑒定結果均為陰性。這可能有以下原因：①在采集樣品后未能及時放入-80 ℃冰箱內保存，在運回實驗室過程中可能溫度過高造成了病毒的損失。②可能是因為采集樣品過少，病毒量太低而未能檢測出來。雖然通過該試驗將不能充分了解江西各地區(qū)野生水禽感染禽流感和新城疫流行情況，但可為今后進一步研究提供有價值的信息和基礎數(shù)據(jù)。

參考文獻

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[3] B·M·卜爾尼克. 禽病學[M].10版.北京：中國農業(yè)出版社，1997：691-792.

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[9] 崔治中.我國新城疫流行現(xiàn)狀[J].中國家禽，2002，24（4）：4-6.

責任編輯 宋平 責任校對 李巖