周小倩 李文莉 趙珍 張菀苓 符婷婷 王繼華

摘要 [目的]了解施用不同濃度的高效氯氰菊酯對滑菇生長狀態(tài)的影響，以確定實際生產(chǎn)中該藥劑施用的最佳稀釋倍數(shù)。[方法]采用控制變量法，研究不同濃度的4.5%乳油狀高效氯氰菊酯對滑菇C3-1和滑菇RH的菌絲體生物量、蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率等的影響。[結(jié)果]施用不同濃度的4.5%乳油狀高效氯氰菊酯對滑菇的生長狀態(tài)都有顯著抑制作用，且抑制作用大小不同。當稀釋倍數(shù)為4 000時，4.5%乳油狀高效氯氰菊酯對滑菇C3-1和滑菇RH的生長都有相對較強的抑制作用；當稀釋倍數(shù)為8 000時，滑菇RH的生長量、菌絲體的蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率均相對較高，均僅次于對照組；當稀釋倍數(shù)為12 000時，滑菇C3-1的生長量、菌絲體的蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率均較高。[結(jié)論]綜合分析，在保證高效氯氰菊酯除蟲滅菌的藥效情況下，4.5%乳油狀高效氯氰菊酯稀釋倍數(shù)以8 000～12 000倍為宜，此時藥劑的使用對菌絲體生長的影響最小。

關(guān)鍵詞 施用模式；高效氯氰菊酯；滑菇；影響

中圖分類號 S436.46 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）27-110-03

滑子菇（Pholiota nameko）別名珍珠菇、滑菇、光帽鱗傘，在日本地區(qū)被稱為納美菇，臺灣地區(qū)叫“珍珠菇”，屬無隔擔子菌亞綱、傘菌目、絲膜菌科[1]?；庸皆a(chǎn)于日本，后在我國黑龍江、遼寧等地進行人工大規(guī)模培養(yǎng)。其表面附著一層滑嫩可口、營養(yǎng)價值極高的黏多糖，蛋白質(zhì)含量高于香菇和平菇，并且低熱量、低脂肪，目前已成為世界上五大宗人工栽培的食用菌之一。但在人工栽培過程中，食用菌極易染菌，病蟲害發(fā)生頻繁，所以要使用農(nóng)藥[2-5]。高效氯氰菊酯是一種新型的擬除蟲菊酯類殺蟲劑，其組成成分主要為氯氰菊酯的高效體，在分子結(jié)構(gòu)與生物活性方面類似于天然除蟲菊酯的仿生農(nóng)藥，具有殺蟲廣譜、高效、低毒、低殘留、對環(huán)境友好等優(yōu)點，所以許多菇農(nóng)選用高效氯氰菊酯作為滑菇栽培的殺蟲劑。但如果藥劑使用不當，就會引起殺蟲效果較差或藥害，造成損失。因此，找出有效的施用濃度是非常有必要的。為此，筆者測定了5種濃度梯度下高效氯氰菊酯對滑菇的影響，以期為滑菇生產(chǎn)過程中合理施用殺蟲劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥劑。

4.5%乳油狀高效氯氰菊酯由江蘇揚農(nóng)化工集團有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 供試菌。菌株為篩選出的優(yōu)勢菌滑菇C3-1和滑菇RH，由哈爾濱師范大學微生物實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基。液體PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，5 g蛋白胨，1 000 ml蒸餾水。

1.1.4 試劑。BCA標準樣品小牛血清蛋白、苯酚、濃硫酸、乙醇、NaCl、鄰苯三酚、鹽酸溶液和Tris-HCl緩沖液（pH 9.0）均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 加藥方式。為模擬菇房養(yǎng)殖的真實情況，首先活化接種滑菇優(yōu)勢菌滑菇C3-1和滑菇RH，接種于固體PDA斜面培養(yǎng)基上，菌絲體在20 ℃培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)。12 d后取0.5 cm2菌絲體接種于液體PDA培養(yǎng)基上。根據(jù)滑菇C3-1和滑菇RH的實際生長情況，在其生長最快的時間點將不同濃度梯度的高效氯氰菊酯加入液體PDA培養(yǎng)基中。由預試驗結(jié)果得知，滑菇C3-1在第12天生長速度最快，所以在相同培養(yǎng)條件下，在滑菇C3-1遮光培養(yǎng)第12天加入不同濃度的高效氯氰菊酯進行試驗?；絉H則在第14天生長速度最快，所以將第14天作為后期加入藥劑的時間點。

1.2.2 加藥培養(yǎng)基的配制。配制液體PDA培養(yǎng)基，將液體培養(yǎng)基定量100 ml分裝于三角瓶中，121 ℃滅菌30 min，冷卻后分別向其中接入0.5 cm2培養(yǎng)于固體PDA培養(yǎng)基中的菌絲體，繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)藥劑的使用說明和前期的文獻調(diào)查[6-8]，將滑菇C3-1在20 ℃下遮光培養(yǎng)至12 d、滑菇RH在20 ℃下遮光培養(yǎng)至14 d時，分別加入稀釋倍數(shù)為4 000、8 000、12 000、16 000及20 000的高效氯氰菊酯，以培養(yǎng)基中加入等量無菌水作為空白對照組（CK），每個濃度梯度重復3次。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)至16 d。

1.2.3 滑菇生長指標測定。反映滑菇生長情況指標有很多，通過對滑菇的生長量、營養(yǎng)成分中蛋白質(zhì)的含量以及超氧陰離子自由基清除率的測定來評定不同濃度高效氯氰菊酯對其生長指標的影響，且用具體數(shù)據(jù)的變化直觀反映出滑菇的生長情況。

1.2.3.1 滑菇生長量。將20 ℃恒溫遮光培養(yǎng)至18 d的菌絲體在烘箱中烘干至恒重后，測定菌絲體干重。

1.2.3.2 菌絲體蛋白質(zhì)含量。采用考馬斯亮藍法[9-11]。首先繪制標準蛋白曲線：稱取0.1 g標準蛋白樣品小牛血清蛋白（BSA）置于10 ml蒸餾水中，搖勻；按不同比例配制成不同濃度的蛋白溶液（表1）；取5.0 ml配制好的考馬斯亮藍G250溶液與配制好的不同濃度的蛋白質(zhì)樣液混勻，倒入比色杯中，用分光光度計測量其在595 nm波長下的OD值，繪制標準曲線。稱取加入不同濃度高效氯氰菊酯的滑菇菌絲體各0.1 g，加入1.0 ml生理鹽水，在組織研磨器中將菌絲體研磨至組織破碎成勻漿狀后，4 ℃浸提3 h，12 000 r/min離心10 min，取其上清得到粗蛋白提取液。將蛋白粗提液進行適當稀釋，當粗提液稀釋30倍后適用考馬斯亮藍法，測定OD值，再與標準蛋白曲線作對照，計算每個樣品中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.2.3 超氧陰離子自由基清除率。分別將5.0 ml提前研磨好的組織研磨液和1.4 ml Tris-HCl緩沖溶液（pH 9.0）加入到大試管中，在25 ℃恒溫水浴中預熱20 min，向其中一支試管加入恒溫水浴已預熱的0.8 ml 30 mmol/L鄰苯三酚溶液，另一支不加。分別用水稀釋至25.0 ml，在室溫下反應15 min，然后于25 ℃恒溫水浴反應4 min，反應完全向其中滴入2滴10 mol/L鹽酸終止反應。以水為參比，測定325 nm波長處體系的吸光度。設(shè)不加鄰苯三酚時體系的吸光度為A1，加入鄰苯三酚后體系的吸光度為A2，則超氧自由基產(chǎn)生量可用ΔA=A1-A2表示。計算超氧陰離子自由基清除率。

清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

式中，A0表示不含研磨液的吸光值；A1表示含有研磨液但不含鄰苯三酚的吸光值；A2表示含研磨液又含鄰苯三酚的吸光值[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效氯氰菊酯對滑菇生長量的影響

由圖1可知，低稀釋倍數(shù)高效氯氰菊酯的使用下滑菇C3-1生長量較低，高濃度的高效氯氰菊酯對滑菇的生長有一定抑制作用，在稀釋倍數(shù)為12 000和16 000時，滑菇C3-1的生長量有明顯回升，幾乎接近對照組（CK），而稀釋倍數(shù)為20 000時生長量又有所降低。

由圖2可知，施用高效氯氰菊酯后對滑菇的生長有一定的抑制，當稀釋倍數(shù)為4 000時，該藥劑對滑菇RH生長狀態(tài)的抑制作用最強；稀釋倍數(shù)為8 000時，滑菇RH的生長量僅次于對照組；在稀釋倍數(shù)為12 000、16 000、20 000時生長量均低于稀釋倍數(shù)為8 000時，變化幅度很小，表明當該藥劑稀釋8 000倍時，滑菇RH的生物量最高。

2.2 高效氯氰菊酯對滑菇蛋白質(zhì)含量的影響

標準蛋白曲線見圖3。蛋白質(zhì)線性回歸方程為y=0.006 9x+0.124 9，R2=0.995，線性關(guān)系良好。

由圖4和圖5可知，當稀釋倍數(shù)為0時，滑菇C3-1和滑菇RH蛋白質(zhì)含量都最高，分別為21.8%和22.3%。高效氯氰菊酯的使用對蛋白質(zhì)有一定的抑制作用。其中，當高效氯氰菊酯稀釋倍數(shù)為4 000時，滑菇C3-1蛋白質(zhì)含量僅為103%。隨著稀釋倍數(shù)的增大，當高效氯氰菊酯的稀釋倍數(shù)為12 000時蛋白質(zhì)含量增長至19.5%，達到施用高效氯氰菊酯后的最高點，而在稀釋倍數(shù)為16 000和20 000時，蛋白質(zhì)含量降低，分別為16.7%和17.1%，說明當稀釋倍數(shù)為12 000時，既能達到消除蟲害又能最小地影響蛋白質(zhì)的含量。對滑菇RH而言，在高效氯氰菊酯稀釋倍數(shù)為4 000倍時，蛋白質(zhì)含量較對照組明顯下降，為17.8%；當稀釋倍數(shù)為8 000時蛋白質(zhì)含量達到施用藥劑的最高含量，為18.9%，僅次于對照組；之后隨著稀釋倍數(shù)的增加滑菇蛋白質(zhì)的含量反而下降，說明稀釋倍數(shù)為8 000是最佳的施藥倍數(shù)，能達到較好的效果。

2.3 高效氯氰菊酯對滑菇超氧陰離子清除率的影響

由圖6可知，在空白對照組稀釋倍數(shù)為0時，超氧陰離子自由基的清除率最高為52.4%；在加入稀釋倍數(shù)為12 000的高效氯氰菊酯時，超氧陰離子自由基清除率較其他稀釋倍數(shù)高；在稀釋倍數(shù)為4 000時，超氧陰離子自由基的清除率最低，而在稀釋倍數(shù)為16 000和20 000時，也有較高的超氧陰離子自由基清除率。

由圖7可知，除對照組外，當高效氯氰菊酯稀釋倍數(shù)為4 000時超氧陰離子自由基的清除率最低，為21.0%；當稀釋倍數(shù)為8 000時超氧陰離子自由基的清除率達到了施用高效氯氰菊酯的最高值，為45.0%；之后隨稀釋倍數(shù)的增加超氧陰離子自由基清除率下降。

3 討論

研究農(nóng)藥的施用對食用菌生長情況的影響時，瓊脂培養(yǎng)皿法是常用的方法。該研究改良了常規(guī)實驗室采用的瓊脂培養(yǎng)皿法來測定農(nóng)藥對食用菌菌絲體生長狀況的影響，以菌絲體在液體PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長最快點加藥的方式作為研究點，既避免了由于高壓滅菌而導致高效氯氰菊酯揮發(fā)失效的弊端，又減少了菌絲體培養(yǎng)初期對藥物敏感的影響，使得研究結(jié)果更加準確、可靠。

該研究通過對不同稀釋倍數(shù)的高效氯氰菊酯施用下的滑菇C3-1和滑菇RH的生長量、蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率的測定來衡量其生長狀況。結(jié)果表明，在稀釋倍數(shù)為4 000時，高效氯氰菊酯的濃度較高，對滑菇C3-1和滑菇RH菌絲體的生長量、蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率均為濃度梯度中的最低值，表明低濃度的高效氯氰菊酯對滑菇菌絲體的生長有一定的抑制作用，所以將農(nóng)藥稀釋到4 000倍并非最佳選擇。當高效氯氰菊酯的稀釋倍數(shù)為12 000時，滑菇C3-1的生長量、菌絲體的蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基的清除率均相對較高。對于滑菇RH來說，當高效氯氰菊酯的稀釋倍數(shù)為8 000倍時，生長量、菌絲體的蛋白質(zhì)含量和超氧陰離子自由基清除率均相對較高，綜合3項試驗結(jié)果分析，在保證高效氯氰菊酯除蟲滅菌的藥效情況下，將4.5%乳油狀高效氯氰菊酯稀釋8 000～12 000倍，藥劑的使用對菌絲體的生長影響最小。因此，建議菇農(nóng)在生產(chǎn)過程中將農(nóng)藥稀釋成適當倍數(shù)再施用，既能達到除蟲滅菌的目的，又能保證滑菇的生長質(zhì)量。

由于是在實驗室內(nèi)測定的4.5%乳油狀高效氯氰菊酯對滑菇菌絲體生長情況的影響，可能對試驗有一定的限制，至于稀釋的藥劑濃度對滑菇子實體形成與生長的影響，有待實際生產(chǎn)中進一步驗證。

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責任編輯 宋平 責任校對 李巖