李文淵 王津慧 童麗 熱增才旦 楊芳 索南鄧登

摘要 采用單因素試驗和4因素3水平的正交試驗相結(jié)合的方法，建立和優(yōu)化甘西鼠尾草穩(wěn)定的ISSR-PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明，甘西鼠尾草20 ul ISSR-PCR體系中各因素的最佳濃度：10×Buffer（Mg2+）2 μl，dNTPs 0.4 mmol/L，Tag酶1.0 U，引物0.3 μmol/L，DNA 30 ng。

關(guān)鍵詞 甘西鼠尾草；ISSR-PCR；優(yōu)化

中圖分類號 S567.23+9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）27-037-02甘西鼠尾草（Salvia przewalskii Maxim.）又名高原丹參，是藏區(qū)常用的藏藥（藏文譯音：吉子恩保），因其有效成分與中藥丹參相似，功能主治亦與丹參相同，在西南、西北地區(qū)甘西鼠尾草普遍作為臨床治療心血管疾病中藥丹參的替代品種[1]。

近年來ISSR技術(shù)已應(yīng)用于植物遺傳分析的各個方面，如品種鑒定[2]、遺傳關(guān)系及遺傳多樣性分析[3-4]、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[5-7]等研究。為確保ISSR分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，進行ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化非常必要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。甘西鼠尾草材料，采自青海省及甘肅省8個不同的居群。

1.1.2 主要試劑與儀器。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB））（國藥集團）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）Solarbio、β-巰基乙醇（AMRESCO）、EDTA（國藥集團）、SDS（國藥集團）、溴化乙錠（EB）Sigma、瓊脂糖（GENETECH），其他試劑為國產(chǎn)分析純。Tag酶、dNTP（Mg+）、10×buffer（TaKaRa）、ISSR引物由上海生工公司合成。冷凍離心機（Eppendorf）、紫外可見分光光度計（上海精科）、 凝膠成像系統(tǒng)（Tanon）、電泳儀（ 北京市六一儀器廠）、水浴鍋（ 東方電工）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取。

以甘西鼠尾草為材料，用改良CTAB法提取DNA。采用1.5%瓊脂糖電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，-20 ℃保存。

1.2.2 ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化。

隨機抽取一樣品的DNA作為模板，ISSR-PCR擴增體系為：在20 μl中，內(nèi)含20 ng模板DNA，1.0U Tag聚合酶，引物0.4 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，2 μl的10×Buffer（內(nèi)含Mg+）。擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，在引物退火溫度下退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

為了優(yōu)化反應(yīng)體系，針對DNA、dNTPs、TagDNA酶和引物用量等，設(shè)置了一系列的濃度梯度，進行單因素試驗（表1），為進一步優(yōu)化反應(yīng)體系，進行正交試驗L9（34）（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 模板DNA用量對ISSR-PCR擴增結(jié)果的影響

由圖1可知，在20 μl反應(yīng)體系中，模板DNA濃度在10～50 ng均能擴增出條帶，由此可知，DNA模板濃度對擴增結(jié)果影響較小，根據(jù)條帶的模糊和缺失與否，最終選用30 ng作為適宜的模板濃度。

2.2 dNTPs用量對ISSR-PCR擴增結(jié)果的影響

由圖2可知，在20 μl反應(yīng)體系中，dNTPs濃度為0.4 mmol/L時，條帶最為清晰，因此選用0.4 mmoI/L作為適宜的dNTPs濃度。

2.3 引物濃度對ISSR擴增結(jié)果的影響

由圖3可知，引物濃度在0.2～0.5 μmol/L時，擴增效率高，譜帶比較全面。綜合考慮，最終選用0.4 μmol/L為適宜的引物濃度。

2.4 TagDNA聚合酶劑量對ISSR-PCR擴增結(jié)果的影響

由圖4可知，TagDNA酶用量在0.75～1.25 U時均可以得到重復(fù)清晰的條帶，且無特異性擴增。從經(jīng)濟適用的角度考慮，確定1.0 U/20 μl為適宜TagDNA聚合酶濃度。

2.5 甘西鼠尾草ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗結(jié)果

由圖5可知，在9個處理中，第4號處理擴增效果最好，譜帶強，多

態(tài)性高。因此甘西鼠尾草最佳ISSR擴增反應(yīng)條件為：反應(yīng)體系10×Buffer 2 μl，DNA模板為30 ng，Primer為0.3 μmol/L，

TagDNA聚合酶為1.0 U，dNTPs 0.4 mmol/L，無菌雙蒸水補足20 μl。

3 討論

ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響因素較多，該試驗在前期進行了大量的預(yù)試驗工作，因此在反應(yīng)條件的摸索上較為順利，最終確定適用于甘西鼠尾草20 μl ISSR-PCR體系中各因素的最佳濃度：10×Buffer（Mg2+）2 μl，dNTPs 0.4 mmol/L，Tag酶1.0 U，引物0.3 μmol/L，DNA 30 ng。此外，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，對同一樣品使用不同廠家的Tag酶，PCR擴增效果會有較明顯的區(qū)別。DNA模板的質(zhì)量也直接影響試驗結(jié)果，在試驗前應(yīng)充分保證DNA模板的純度。

參考文獻

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