劉蕊

摘要：文章采用220B型BOD快速測(cè)定儀，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品及不同行業(yè)的廢水中的BOD進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行大量的對(duì)比分析實(shí)驗(yàn)，著重論述了在日常工作中常出現(xiàn)的問(wèn)題及被忽視的問(wèn)題，并指出了微生物傳感器法存在的問(wèn)題，最后展望了BOD快速測(cè)定的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：微生物；菌膜；電位

隨著環(huán)境保護(hù)事業(yè)的蓬勃發(fā)展，各級(jí)環(huán)境監(jiān)測(cè)部門(mén)加強(qiáng)了對(duì)水體中有機(jī)污染狀況的監(jiān)測(cè)，其中BOD項(xiàng)目的監(jiān)測(cè)作用是其他項(xiàng)目無(wú)法替代的。在各項(xiàng)科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量管理體系下，在實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控手段完備的條件下，本文以HJ/T86-2002《微生物傳感器快速測(cè)定法》作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各行業(yè)實(shí)際樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，指出了該方法的影響因素、注意事項(xiàng)及應(yīng)用范圍，并闡述該方法存在的問(wèn)題和解決方法。

一、儀器與試劑

（一）儀器

本文所使用的儀器是220B型BOD快速測(cè)定儀（天津賽普環(huán)保科技發(fā)展有限公司）。

（二）試劑

1. 磷酸鹽緩沖溶液（0.5mol/L）：68g磷酸二氫鉀和71g磷酸氫二鈉用蒸餾水溶解后移入1000ml容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線。

2. 磷酸鹽緩沖溶液使用液（0.005mol）：用上述溶液稀釋100倍。

3. 葡萄糖-谷氨酸（BOD）標(biāo)準(zhǔn)溶液（2500±37mg/L）：稱(chēng)取在103℃下干燥1小時(shí)并冷卻至室溫的無(wú)水葡萄糖和谷氨酸各1.705g，融于磷酸鹽緩沖溶液使用液，并用此溶液稀釋至1000ml，混合均勻。

二、實(shí)驗(yàn)部分

（一）數(shù)據(jù)

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比對(duì)，與稀釋接種法的比較數(shù)據(jù)如下表1所示。

在大量樣品分析的基礎(chǔ)上（見(jiàn)表1），與標(biāo)準(zhǔn)稀釋法相比，微生物傳感器快速測(cè)定BOD法具有以下特點(diǎn)。一是操作易行、監(jiān)測(cè)時(shí)間短。微生物傳感器快速測(cè)定BOD的測(cè)量時(shí)間是8min，清洗時(shí)間是25min，能迅速反映水質(zhì)情況，以實(shí)現(xiàn)快速監(jiān)測(cè)。二是標(biāo)準(zhǔn)稀釋法所需時(shí)間長(zhǎng)，并且實(shí)驗(yàn)步驟中難免出現(xiàn)人為或客觀條件出現(xiàn)誤差，影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度。而微生物法中機(jī)器對(duì)溫度控制的精度好（溫度設(shè)置為33℃），實(shí)驗(yàn)過(guò)程全部在恒溫條件下監(jiān)測(cè)，避免了硝化作用產(chǎn)生的影響。三是對(duì)可生化性好的水樣測(cè)定穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。與標(biāo)準(zhǔn)稀釋法5d的培養(yǎng)過(guò)程相比，微生物快速法測(cè)定可生化性好的水樣時(shí)，BOD數(shù)值比較穩(wěn)定，精度高，避免了標(biāo)準(zhǔn)稀釋法的一系列監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)偏差。

同時(shí)，微生物快速法測(cè)定BOD也存在以下幾個(gè)問(wèn)題。一是當(dāng)監(jiān)測(cè)的實(shí)際樣品中含有毒有害物質(zhì)（如農(nóng)藥類(lèi)、高濃度殺蟲(chóng)劑、游離氯廢水等）時(shí)，會(huì)減少甚至殺死微生物菌種。因此，此類(lèi)水樣不適用此方法測(cè)定。二是當(dāng)樣品中懸浮物達(dá)到一定濃度時(shí)，會(huì)干擾樣品的測(cè)定，影響數(shù)值的準(zhǔn)確度。此時(shí)，應(yīng)在樣品靜置30分鐘后，再取中間液進(jìn)行分析。三是此方法測(cè)定BOD項(xiàng)目，主要依靠生物膜內(nèi)的微生物菌種活性，菌種的活性在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。在關(guān)注菌種生存周期的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)際樣品的實(shí)際情況合理使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)工作。

（二）微生物膜的活化及更換

將菌膜放入0.005mol/L緩沖溶液中活化一周左右，其活化過(guò)程應(yīng)在溫度保持21℃左右的恒溫恒濕箱內(nèi)進(jìn)行，然后將其安裝在微生物傳感器上。菌膜上的菌種作為活性物質(zhì)是有壽命的，除溫度、濕度影響其壽命以外，主要受使用頻率、水樣污染程度、使用期間的維護(hù)和保養(yǎng)等的影響。當(dāng)遇到以下情形時(shí)須更換生物膜：一是連續(xù)正常工作30天以上；二是驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)溶液的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的靈敏度下降；三是正常的菌種被傷害或是被殺死；四是菌膜正常工作后連續(xù)停機(jī)7天以上。當(dāng)機(jī)器使用頻率低時(shí)，必須保證每周用緩沖溶液清洗機(jī)器1～2次。在保證初始電位在4～10之間時(shí)可持續(xù)使用菌膜。靈敏度是衡量生物膜工作是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，若靈敏度數(shù)值在下降，則需及時(shí)更換生物膜。

（三）標(biāo)準(zhǔn)系列的確定

微生物的菌種與待測(cè)水樣（非有毒有害的）存在“共生”關(guān)系。樣品的BOD濃度影響微生物的活性，樣品通過(guò)微生物監(jiān)測(cè)獲得BOD濃度值。為保證監(jiān)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般用兩點(diǎn)定標(biāo)進(jìn)行分析。根據(jù)不同行業(yè)和來(lái)源的水樣，總結(jié)歸納并選擇相應(yīng)適合的控制濃度電位進(jìn)行定標(biāo)工作，并且每個(gè)工作日至少定標(biāo)一次。根據(jù)樣品的實(shí)際情況，有條件的可以選擇每批次樣品定標(biāo)一次或多次，以確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。在機(jī)器正常運(yùn)行且菌膜活性良好的條件下，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)得到一組樣品濃度與之相對(duì)應(yīng)電位值數(shù)據(jù)（見(jiàn)表2）。數(shù)據(jù)僅供參考。若樣品濃度相對(duì)應(yīng)的電位值降低10%，可作為更新菌膜的依據(jù)。

（四）管路的更換

當(dāng)蠕動(dòng)泵進(jìn)樣速度不為勻速時(shí)，可能是管路老化造成的，此時(shí)應(yīng)考慮更換管路。當(dāng)監(jiān)測(cè)工作密度加強(qiáng)，管路中必然存留微生物，從而導(dǎo)致管路液體流速下降。根據(jù)儀器要求需定期更換管路。管路更換時(shí)間與機(jī)器的使用頻率、水樣的來(lái)源及污染程度，以及管路的材質(zhì)等均有關(guān)系。因此，在日常維護(hù)中，在保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確的前提下，可依據(jù)儀器使用頻率和水樣的污染程度等更換管路。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣品分析數(shù)據(jù)的精密度下降時(shí)即可更換管路。

（五）干擾物質(zhì)的控制

表3介紹了幾種干擾物的最大限量，通過(guò)對(duì)大量樣品反復(fù)實(shí)驗(yàn)，在保證測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，列出較適宜的低于最大限值的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值。含0.5mg/L以下的游離氯一般對(duì)數(shù)據(jù)的結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生明顯的干擾，而且還能對(duì)管路、流通池、菌膜有一定的清洗作用。含高濃度的游離氯的樣品可加入1.575mg/L的亞硫酸鈉溶液（不宜過(guò)量，否則產(chǎn)生負(fù)干擾），使游離氯或結(jié)合氯去除。被測(cè)樣品中的懸浮物對(duì)BOD測(cè)定的干擾是令人關(guān)注的問(wèn)題，為此進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。由于六次甲基四胺在測(cè)定中會(huì)產(chǎn)生干擾，因此選用硅藻土作為懸浮物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并配成懸浮物50mg/L、102mg/L、280 mg/L的溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表4、表5、表6）

從表4、表5、表6中可以看出，含有5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的BOD溶液的樣品中懸浮物含量從50～280 mg/L對(duì)BOD的測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差分別在-2.0～6.0、-2.4～6.0%、-2.0～3.2%之間，因此在標(biāo)準(zhǔn)中確定為含有懸浮物濃度低于250mg/L的樣品， BOD項(xiàng)目的測(cè)定結(jié)果影響很小。

（六）緩沖溶液的選擇

測(cè)定樣品的pH值應(yīng)控制在7左右。因此，選擇混合磷酸鹽作為緩沖溶液，一方面可以在一定程度上緩沖調(diào)節(jié)樣品的pH值，使其符合測(cè)定的要求，另一方面也可對(duì)含有高濃度的重金屬離子的樣品起到沉降的作用。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：樣品的pH值在4～10之間時(shí)，不需要對(duì)水樣進(jìn)行酸堿處理即可符合正常的監(jiān)測(cè)條件。

（七）管路氣、液比的調(diào)整

儀器進(jìn)樣管路中的氣液比是廠家在大量反復(fù)實(shí)驗(yàn)后得出的經(jīng)驗(yàn)理論值，可在儀器使用前設(shè)定好，也可在實(shí)際運(yùn)行操作中進(jìn)行調(diào)整，但總原則是保證流通池中有充分的氧。為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，在保證樣品代表性的前提下，在測(cè)定過(guò)程中進(jìn)樣總量必須大于10ml。

（八）樣品測(cè)定時(shí)間

根據(jù)儀器的操作規(guī)程，測(cè)定樣品的時(shí)間設(shè)定是8min，清洗時(shí)間為25 min。樣品測(cè)定時(shí)間與樣品濃度是成比例的，為保證測(cè)定周期內(nèi)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，一般要求樣品濃度低于50mg/L（25mg/L左右最佳）。若樣品濃度低，分析時(shí)間會(huì)相應(yīng)縮短，與工作曲線的線性范圍0～50 mg/L是相吻合的。

（九）樣品的貯存

國(guó)內(nèi)各標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)對(duì)BOD項(xiàng)目水樣的保存提出了“即測(cè)定值將隨水樣貯存時(shí)間而降低……”，分別探討了4℃、-22℃、酸化至pH為1.5和酸化并在-22℃四種條件下保存，以上方法盡非人意。因此，總原則是貯存時(shí)間應(yīng)盡量縮短。我國(guó)《地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定BOD樣品的保持條件為0℃～5℃避光，一般采樣后6小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)，若需遠(yuǎn)距離運(yùn)轉(zhuǎn)，在任何情況下貯存不能超過(guò)24小時(shí)。國(guó)外有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)規(guī)定了對(duì)采集的樣品2小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析的，無(wú)需冷藏。采集樣品2小時(shí)后分析的樣品需保存在4℃以下，冷卻降溫至接近冰點(diǎn)以減少誤差。當(dāng)不能在6小時(shí)內(nèi)分析時(shí)，實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)標(biāo)注保存時(shí)間與溫度。對(duì)于貯存時(shí)間大于24小時(shí)的樣品不能分析。配制標(biāo)準(zhǔn)樣品的分析結(jié)果一定要在6小時(shí)內(nèi)完成。

表7中1～6樣品均為處理后的廢水樣品，7～8樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣品。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，在對(duì)處理后的廢水中BOD濃度放置8小時(shí)后，其濃度降低了20%左右。樣品的貯存在分析中易被忽視且樣品保存客觀上也存在的問(wèn)題，應(yīng)用快速監(jiān)測(cè)法來(lái)解決樣品保存難題。

三、分析過(guò)程中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題

（一）每日必做的檢查

每日在開(kāi)機(jī)后，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，應(yīng)先檢查初始電位是否在正常范圍內(nèi)，檢查清洗液是否流動(dòng)順暢，再檢查流量和氣量是否在正常范圍內(nèi)，然后在進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)。

（二）菌膜的培養(yǎng)和調(diào)試

在菌膜培養(yǎng)過(guò)程中，至少應(yīng)培養(yǎng)7天以上，一般在15天，溫度控制在21℃左右。及時(shí)更換營(yíng)養(yǎng)液（濃度為0.005 mol /L磷酸鹽緩沖溶液使用液），每天營(yíng)養(yǎng)液約需500ml。當(dāng)培養(yǎng)完畢裝入電極內(nèi)后，需加入同一系列標(biāo)樣（數(shù)量控制在20個(gè)左右）來(lái)激活菌膜的活性。標(biāo)樣一般所需的濃度在20～30mg/L，調(diào)試周期在3天左右。當(dāng)△I值在5～9之間時(shí)，首先比較電位與濃度的比例是否合理，其次比較加入的系列標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)偏差（<1%）是否在合理范圍內(nèi)，若比例合理便可正常進(jìn)行水質(zhì)分析。新?lián)Q的菌膜，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，應(yīng)多給一些濃度在15～20 mg/L的標(biāo)液走樣，期間可少量穿插30～40mg/L的標(biāo)樣以刺激并保證菌膜的活性。

（三）當(dāng)起始電位在正常范圍內(nèi)出現(xiàn)異常波動(dòng)

分析過(guò)程中，在正常范圍起始電位出現(xiàn)異常波動(dòng)（即波動(dòng)超過(guò)0.05的范圍）時(shí)，首先檢查透氧膜是否破損。若無(wú)異常，再檢查生物膜是否異位或破損。若再無(wú)異常，再做空載實(shí)驗(yàn)檢查電極是否出現(xiàn)問(wèn)題。

（四）測(cè)定儀換膜后的起始電位（>10）不正常

首先檢查菌膜是否松動(dòng)，菌膜應(yīng)緊貼電極透氧膜，勿破損或折皺透氧膜。其次，增加清洗時(shí)間，甚至是清洗一天，隨著時(shí)間電位會(huì)逐步降低，如若電位仍不在正常范圍內(nèi)，則應(yīng)重新正確安裝透氧膜，至起始電位恢復(fù)到正常范圍內(nèi)為準(zhǔn)。

（五）緩沖溶液不能正常流動(dòng)，機(jī)器不能正常進(jìn)行清洗工作

首先，檢查機(jī)器的流量和氣量是否正常，若有異常調(diào)整其運(yùn)行狀態(tài)至正常。其次，檢查緩沖泵是否能正常運(yùn)轉(zhuǎn)。最后，檢查清洗的管路是否暢通，若管路使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或樣品等原因造成管路堵塞問(wèn)題，應(yīng)及時(shí)更換新的管路。

（六）樣品測(cè)試過(guò)程中進(jìn)樣時(shí)的注意事項(xiàng)

進(jìn)樣時(shí)應(yīng)避免輸液管路進(jìn)入氣泡，測(cè)量過(guò)程中的進(jìn)樣濃度應(yīng)從低到高，以減少回復(fù)到空白電位所需的時(shí)間。勿使其他溶液漏入電極內(nèi)參比溶液中，以免造成污染。

另外，關(guān)機(jī)后再開(kāi)機(jī)至少間隔15秒，否則儀器不能正常工作。

此上是在執(zhí)行和貫徹標(biāo)準(zhǔn)方法過(guò)程中的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)論和使用方法，是日常容易出現(xiàn)并應(yīng)注意的問(wèn)題。

（作者單位：天津市濱海新區(qū)大港環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站）