張繼友　景曉輝　吳倫英　劉國道

摘 要 尖孢鐮刀菌古巴?；颓秩鞠憬兑鸬南憬犊菸?yán)重危害中國香蕉產(chǎn)業(yè)。植物防衛(wèi)素是一類小的富含半胱氨酸的抗真菌蛋白。本研究旨在了解西瓜（Citrullus lanatus）防衛(wèi)素蛋白ClPDF2.1對香蕉枯萎病菌的抑制活性。提取西瓜RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以西瓜cDNA為模板，克隆ClPDF2.1基因，將測序正確的ClPDF2.1連接到載體pGEX-6P-1，隨后轉(zhuǎn)化Trans BL21（DE3）pLysS，IPTG 誘導(dǎo)GST-ClPDF2.1融合蛋白表達(dá)16 h后，經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定GST-ClPDF2.1融合蛋白的表達(dá)，進(jìn)行GST-ClPDF2.1融合蛋白體外抑制香蕉枯萎病菌生長的功能初探。本研究為進(jìn)一步培育轉(zhuǎn)基因香蕉抗病品種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 西瓜防衛(wèi)素基因ClPDF2.1；原核表達(dá)；抗真菌活性；香蕉枯萎病菌

中圖分類號 S651 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Banana wilt disease， caused by the pathogenic fungus Fusarium oxysporum f. sp. cubense 4（Foc 4）， is regarded as one of the mostserious threat to banana production. Plant defensins are cysteine-rich innate anti-microbial proteins that play an important role in plant disease resistance， particularly to fungal diseases. In this paper， watermelon defensin ClPDF2.1 cDNA sequences were cloned and then inserted into vector pGEX-6P-1 with glutathione-S-transferase（GST）tag to construct the prokaryotic expression plasmid. The recombinant plasmids pGEX-6P-1-ClPDF2.1 were transformed into Trans BL21（DE3）pLysS and expressed in the prokaryotic expression system. Results of SDS-PAGE and western blot after Glutathione Sepharose 4B affinity chromatography purification， showed that the specific fusion protein was successfully constructed and expressed after IPTG induction. The antifungal activity of watermelon defensins proteins ClPDF2.1 against Foc 4 growth indicated that ClPDF2.1 could decrease Foc 4 hypha growth by 81.7% at eighty micromolar concentration. This study showed that ClPDF2.1 could be a potential resistance gene for controlling banana Fusarium wilt disease.

Key words Watermelon defensin gene ClPDF2.1； Prokaryotic expression； Antifungal activity； Fusarium oxysporum f. sp. cubense 4

香蕉是中國重要的熱帶水果，然而隨著香蕉枯萎?。‵usarium wilt disease）在包括海南、廣東在內(nèi)的多個省份不斷蔓延的同時，香蕉種植面積不斷減少，香蕉產(chǎn)業(yè)遭受了嚴(yán)重的打擊[1]。香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum Schlecht f. sp. cubense WC Snyder & HN Hans， Foc）侵染香蕉后引起的一種典型維管束病害[2]。香蕉枯萎病菌4號生理小種（Foc 4）能侵染包括Cavendish在內(nèi)的幾乎所有香蕉品種，截至目前仍無有效的防治措施[2]。目前關(guān)于香蕉枯萎病的研究主要集中在拮抗菌株的篩選[3]和枯萎病菌致病相關(guān)基因的克隆[4]等方面，而對于源自香蕉或其它植物的香蕉枯萎病抗性基因挖掘不多。

植物防衛(wèi)素是一類小的富含半胱氨酸的抗真菌蛋白，被認(rèn)為對動植物無毒[5]。通過人工合成、原核表達(dá)或轉(zhuǎn)基因育種，多個植物防衛(wèi)素對多種植物病害的防控起到顯著作用[5]。然而，截至目前，研究較為清楚的植物防衛(wèi)素種類不多，主要包括RsAFP2、MsDef1、MtDef4、NaD1[5]，其中NaD1以二聚體的形式發(fā)揮對尖孢鐮刀菌的抗性[6]。本團(tuán)隊前期研究表明苜蓿MtDef4能夠抑制橡膠多主棒孢病菌（Corynespora cassiicola）生長而不能抑制橡膠膠孢炭疽菌（Collectotrichum gloeosporioides）的生長[7]。2013年，張曼等[8]從西瓜中克隆出西瓜防衛(wèi)素基因ClPDF2.1，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)受到外源植物激素水楊酸（Salicylic Acid）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate）、乙烯利（ethephon）和西瓜枯萎病菌的誘導(dǎo)。本研究擬利用原核表達(dá)技術(shù)體外純化ClPDF2.1，研究其對香蕉枯萎病菌生長的抑制能力，為將來通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病香蕉品種提供潛在候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 西瓜種子由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所提供，播種于溫室。原核表達(dá)載體pGEX-6P-1購自GE Healthcare Life Sciences，大腸桿菌菌株E. coli Trans 5α、原核表達(dá)菌株Trans BL21（DE3）pLysS化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。香蕉枯萎病菌4號生理小種菌株B2（Foc B2）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所黃俊生研究員提供。

1.1.2 試劑 植物總RNA提取試劑盒、TIANScriptⅡcDNA第一鏈合成試劑盒、DNA產(chǎn)物純化和膠回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Invitrogen公司；TransStart FastPfu DNA Polymerase、anti-GST抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Bradford 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基購買自環(huán)凱微生物科技，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 ClPDF2.1基因克隆 利用植物總RNA提取試劑盒提取西瓜葉片RNA，利用TIANScriptⅡcDNA第一鏈合成試劑盒將西瓜RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于隨后的ClPDF2.1基因克隆。

根據(jù)報道的ClPDF2.1開放閱讀框序列[7]，設(shè)計帶有酶切位點的引物ClPDF2.1-F：CACGAATTCAT

GAAGTTCTTTTCCGCTGC；ClPDF2.1-RATACTCGAG

TCAAACGCAGTGCTTTGTG。PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR條帶大小。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 利用EcoRI和XhoI對PCR擴(kuò)增的ClPDF2.1基因和帶有GST標(biāo)簽的pGEX-6P-1載體雙酶切，電泳后按照膠回收試劑盒說明書的步驟切膠回收ClPDF2.1基因（225 bp）和pGEX-6P-1載體。在10 μL連接體系中加入如下組分：1 μL 酶切后的pGEX-6P-1載體+8 μl ClPDF2.1基因片段+1 μL T4 連接酶緩沖液+1 μL T4連接酶。23 ℃連接5 h后全部用于轉(zhuǎn)化Trans 5α藍(lán)白斑篩選，在氨芐抗性的LB平板上挑取白色菌落，進(jìn)行菌落PCR初步鑒定陽性克隆后用EcoRI和XhoI雙酶切鑒定后再交由上海生工測序。將測序正確的質(zhì)粒pGEX-6P-1-ClPDF2.1轉(zhuǎn)化Trans BL21（DE3）pLysS，得到GST-ClPDF2.1。GST為陰性對照。

1.2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及western blot檢測 挑取測序正確的GST-ClPDF2.1單克隆接種到4 mL 氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中（氨芐終濃度為50 μmmol），200 r/min 轉(zhuǎn)速下37 ℃過夜培養(yǎng)，隨后將菌液以1 ∶ 100的比例加入到400 mL 氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌液OD600=0.6左右，加入終濃度為1 mmol的IPTG，在16 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)8 h誘導(dǎo)GST融合蛋白的表達(dá)，4 000 r/min離心10 min收集菌體，用PBS緩沖液將沉淀懸起，經(jīng)超聲破碎細(xì)胞后（20 mL裂解體系，400～600 W，超聲3 s，暫停3 s，時間約15 min），13 000 r/min離心10 min，上清于-80 ℃保存?zhèn)溆?。pGEX-6P-1為陰性對照。

分別取10 μL稀釋100倍的GST-ClPDF2.1和GST上清液，加入2 μL 5×SDS loading buffer，輕輕顛倒混勻，100 ℃沸水浴煮5 min變性蛋白，用于后續(xù)的SDS-PAGE電泳（5%濃縮膠，12%分離膠）。電泳結(jié)束后利用Bio-Rad濕轉(zhuǎn)儀將GST-ClPDF2.1蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，用Anti-GST抗體4 ℃孵育2 h，TBST緩沖液洗掉未與靶蛋白結(jié)合的Anti-GST（重復(fù)洗脫3次），加入二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗掉未結(jié)合的二抗（重復(fù)洗脫3次）。按照ECL發(fā)光試劑盒（GE Healthcare）說明書步驟檢測GST-ClPDF2.1和GST蛋白的表達(dá)。

1.2.4 GST-ClPDF2.1融合蛋白的純化 取出-80 ℃保存的GST-ClPDF2.1融合蛋白（30 mL），加入1 mL經(jīng)預(yù)冷的PBS緩沖液處理的GST Agarose Beads，4 ℃冰箱反復(fù)顛倒混勻1 h（促進(jìn)GST-ClPDF2.1與GST Agarose Beads結(jié)合），2 000×g 4 ℃條件下離心3 min后棄上清，20 mL預(yù)冷的PBS緩沖液反復(fù)清洗GST Agarose Beads，重復(fù)2次（洗凈未與樹脂結(jié)合的雜蛋白）。加入1 mL GST Elution Buffer，輕輕顛倒混勻10 min左右競爭洗脫GST-ClPDF2.1。GST為對照。利用Bradford蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定純化的GST和GST-ClPDF2.1融合蛋白濃度。

1.2.5 GST-ClPDF2.1融合蛋白對香蕉枯萎病菌體外抑菌活性檢測 配制含80 μmol GST-ClPDF2.1的PDA培養(yǎng)基（4.01 g PDA粉末溶于100 mL無菌水中），用打孔器（10 mm）打取香蕉枯萎病菌Foc B2菌塊放置于PDA平板中央，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4 d后觀察GST-ClPDF2.1對Foc B2生長的抑制情況。含相同濃度GST的PDA培養(yǎng)基接種Foc B2為對照，每個處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-ClPDF2.1的構(gòu)建及鑒定

筆者提取出高質(zhì)量的西瓜葉片RNA，其中28S rRNA亮度約為16S rRNA的2倍（圖1-A）。以西瓜cDNA為模板，用帶有酶切位點的ClPDF2.1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到ClPDF2.1基因編碼區(qū)（圖1-B）。采用菌落PCR鑒定陽性克隆，經(jīng)雙酶切后得到一條約250 bp的條帶（圖1-C），與預(yù)期ClPDF2.1大小一致，再經(jīng)上海生工測序，筆者成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-ClPDF2.1。

2.2 GST-ClPDF2.1融合蛋白的誘導(dǎo)

重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-ClPDF2.1轉(zhuǎn)化大腸桿菌原核表達(dá)菌株Trans BL21（DE3）pLysS后，用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后的Anti-GST進(jìn)行western-blot檢測。筆者發(fā)現(xiàn)利用Trans BL21（DE3）pLysS菌株可大量誘導(dǎo)25 ku的GST和34 ku的GST-ClPDF2.1（圖2）。

GST Agarose Beads進(jìn)一步純化GST和GST-ClPDF2.1后，利用Bradford蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，將GST和GST-ClPDF2.1終濃度調(diào)整為1 mmol。

2.3 GST-ClPDF2.1融合蛋白對香蕉枯萎病菌體外抑菌活性檢測

在含有相同濃度GST和GST-ClPDF2.1的PDA培養(yǎng)基上，接種10 mm香蕉枯萎病菌菌塊，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4 d后筆者發(fā)現(xiàn)：在含有80 μmoL GST的PDA平板上，香蕉枯萎病菌生長正常，菌落直徑達(dá)到6 cm（表1）；在含有80 μmol GST-ClPDF2.1的PDA平板上，香蕉枯萎病菌幾乎沒有任何生長，菌落直徑為1.1 cm（表1）。ClPDF2.1抑制香蕉枯萎病生長率達(dá)到81.7%（圖3），這說明ClPDF2.1具有較大的潛力成為將來香蕉枯萎病抗性基因。

3 討論與結(jié)論

植物防衛(wèi)素（defensins）又名植物抗微生物蛋白（plant antimicrobial proteins， AMPs），指的是一類廣泛分布于自然界多種植物抗真菌蛋白[9]。體外的抑菌活性以及防衛(wèi)素的廣泛分布性表明其可能在植物對病原菌抗性中發(fā)揮重要作用[10]。植物防衛(wèi)素很可能通過靶向真菌細(xì)胞膜鞘脂類受體進(jìn)而發(fā)揮功能[5]。景曉輝等[7]發(fā)現(xiàn)GST-MtDef4融合蛋白能夠抑制多主棒孢病菌生長，抑菌率達(dá)到60%。Gaspar等[11]發(fā)現(xiàn)棉花過表達(dá)植物防衛(wèi)素NaD1后獲得對尖孢鐮刀菌顯著抗性的轉(zhuǎn)基因棉。Kong等[12]在煙草和馬鈴薯體內(nèi)利用根特異啟動子驅(qū)動山葵防衛(wèi)素（Wasabi defensin）基因表達(dá)，獲得了對尖孢鐮刀菌顯著抗性的轉(zhuǎn)基因植株。

近年來關(guān)于香蕉枯萎病的報道主要集中于枯萎病菌的real time PCR檢測[13-15]，利用生物有機(jī)肥[16]、內(nèi)生細(xì)菌[17]防控香蕉枯萎病。然而上述措施難以從根本上消除枯萎病菌對香蕉產(chǎn)業(yè)造成的影響。2014年Ghag等[18]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在香蕉中過表達(dá)鵝腸草（Stellaria media）防衛(wèi)素基因Sm-AMP-D1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因香蕉對香蕉枯萎病1號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1）具有明顯的抗性，然而Sm-AMP-D1能否防控香蕉枯萎病菌4號生理小種有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)ClPDF2.1與GST標(biāo)簽蛋白融合后能夠正確表達(dá)，未形成難以純化的包涵體。體外抑菌實驗表明ClPDF2.1幾乎完全抑制香蕉枯萎病菌的生長。雖然現(xiàn)階段筆者并不清楚ClPDF2.1的作用機(jī)理，參考其他植物防衛(wèi)素抑制真菌生長的作用機(jī)制，筆者推測可能是由于ClPDF2.1能夠特異與香蕉枯萎病菌細(xì)胞膜存在的鞘脂互作，進(jìn)而導(dǎo)致ClPDF2.1進(jìn)入香蕉枯萎病菌細(xì)胞抑制菌絲的生長?？紤]到香蕉的主要實用部分為果實，而香蕉枯萎病菌為土傳病害，主要從香蕉幼苗根系侵染香蕉，在將來培育轉(zhuǎn)基因抗病香蕉時，可借助香蕉根特異啟動子來驅(qū)動ClPDF2.1在根部特異表達(dá)，以期最終獲得抗香蕉枯萎病菌轉(zhuǎn)基因香蕉。

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