劉承軍

摘 ?要：通過(guò)9日齡海蘭雛雞不同途徑接種雞源鏈球菌，觀察雛雞感染鏈球菌后的臨床癥狀和病理變化，研究不同途徑接種雞源鏈球菌對(duì)雛鴨的致病性是否存在差異，以期為禽類鏈球菌病的臨床診斷和合理防控提供科學(xué)的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鏈球菌;致病力;差異

中圖分類號(hào)：S858.312.5+2 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2015）07-0045-03

禽鏈球菌在自然界和飼養(yǎng)環(huán)境中普遍存在，是大部分禽類腸道正常菌叢的組成部分。因此，一般認(rèn)為禽鏈球菌為非致病菌，其感染多為繼發(fā)性感染，未能引起禽類養(yǎng)殖者和獸醫(yī)工作者的關(guān)注與重視。然而，隨著禽類集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，該病在我國(guó)部分地區(qū)發(fā)病率逐年提高，且造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)通過(guò)不同接種途徑，研究鏈球菌對(duì)雛雞致病性的差異，為更好防控該病提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

1.1.1 ?設(shè)備 ?輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、一次性切片刀、電熱干燥箱、漂烘處理儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱、潔凈工作臺(tái)CJ-1B、自動(dòng)磨刀機(jī)、高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)、Nikon80i生物光學(xué)顯微鏡。

1.1.2 ?毒株 ?雞源鏈球菌，聊城市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心病理實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.1.3 ?試驗(yàn)動(dòng)物及分組 ?一日齡海蘭雛雞24羽，飼喂肉用仔雞前期配合飼料自由采食飲水正常飼養(yǎng)9日后，經(jīng)血液檢查無(wú)細(xì)菌感染后，隨機(jī)分為4組，每組6羽，分別為腹腔組、皮下組、顱內(nèi)組、對(duì)照組。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?細(xì)菌的復(fù)蘇和純化 ?供試菌株接種于TSA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取單個(gè)菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，純培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 ?培養(yǎng)特性和細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察 ?無(wú)菌挑取純化的菌液接種于TSA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)和染色特征。

1.2.3 ?感染菌液的制備和濃度測(cè)定 ?挑取TSA培養(yǎng)基上經(jīng)純化的單個(gè)菌落，接種于15ml TSB液體培養(yǎng)基，搖勻純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18h，利用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算制備菌液中活菌數(shù)為1.5×10CFU/ml。

1.2.4 ?動(dòng)物試驗(yàn) ?四個(gè)試驗(yàn)組分別為腹腔組、皮下組、顱內(nèi)組、對(duì)照組，分別采用腹腔接種、皮下接種、顱內(nèi)接種的接種方式，接種注射劑量為0.2ml/只，對(duì)照組不作實(shí)驗(yàn)處理。

感染后每天觀察各組雞臨床癥狀，記錄發(fā)病和死亡時(shí)間及數(shù)量;定期采集血液標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查：死亡雞及時(shí)進(jìn)行尸體剖檢，剖檢時(shí)觀察記錄各組織及臟器病變，取肝臟、脾臟、腦、心臟及心包膜、肺、腎臟、腔上囊、胸腺、十二指腸等組織器官，用中性福爾馬林固定。其他各試驗(yàn)組未死亡雞和對(duì)照組繼續(xù)正常飼養(yǎng)，觀察記錄臨床癥狀，14d后全部宰殺、剖檢，剖檢時(shí)觀察記錄各組織及臟器病變，取肝臟、脾臟、腦、心臟及心包膜、肺、腎臟、腔上囊、胸腺、十二指腸等組織器官，用中性福爾馬林固定，并分組編號(hào)。

1.2.5 ?病原菌的分離與鑒定 ?解剖死亡病雞，取出病變的肝臟涂片，作革蘭氏染色。并接種于TSA血清平板上，37℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落作革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)和染色特征。

1.2.6 ?病理切片制作和病理組織學(xué)觀察 ?各組織器官用中性福爾馬林固定兩周后，按常規(guī)方法制作石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)H.E染色，光鏡下觀察記錄病理組織學(xué)變化。

2 ?結(jié)果

2.1 ?細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果 ?對(duì)臨床死亡雞的腦組織和心血進(jìn)行細(xì)菌分離，分離菌在TSA血清板上長(zhǎng)成表面濕潤(rùn)、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落，直徑約1mm。革蘭氏染色為陽(yáng)性球菌，單個(gè)、成對(duì)或成短鏈狀排列，與接種菌一致。

2.2 ?發(fā)病情況及臨床癥狀 ?頸部皮下組：雛雞接種后第2d開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀，精神不振，眼瞼腫脹，頭部羽毛蓬松，食欲下降，黃色稀糞，病程持續(xù)7d后精神有所好轉(zhuǎn)，但雛雞眼部分泌物逐漸增多，頸部皮毛較稀，生長(zhǎng)緩慢，發(fā)病率100%（6/6），于接種后第3d死亡第一羽，死亡4羽。

腹腔組：雛雞接種后2d精神不振，頭部羽毛蓬松，眼瞼腫脹，喜臥惡動(dòng)，排黃色稀糞，發(fā)病率100%（6/6），死亡2羽。第13d精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，第15d精神狀態(tài)和食欲正常，生長(zhǎng)緩慢。

顱內(nèi)組：接種當(dāng)天死亡一羽，懷疑為接種顱內(nèi)操作致死，其它接種3d精神不振，眼瞼腫脹，排黃綠稀糞，發(fā)病率100%（6/6），死亡3羽。

空白對(duì)照組： 6羽雛雞精神狀態(tài)和食欲正常，好動(dòng)，羽毛光滑，生長(zhǎng)速度較快。

2.3 ?發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)表 ?見(jiàn)表1、表2、表3。

3 ?討論

不同接種途徑對(duì)雛雞致病性試驗(yàn)，菌液濃度相對(duì)較高的，人工復(fù)制病變比較典型。這與鏈球菌在部分地區(qū)發(fā)病率較高相吻合，在實(shí)際雛雞養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)引起對(duì)禽鏈球菌病的重視。經(jīng)頸部皮下接種感染雛雞的病變最為嚴(yán)重，死亡率最高。腹腔接種途徑人工復(fù)制病變也很明顯，但顱內(nèi)接種途徑致病性最弱。頸部皮下接種表現(xiàn)出的高致病性，與這種接種途徑比較接近于雛雞的胸腺有關(guān)，胸腺在機(jī)體中作為免疫中樞器官，在雛雞早期個(gè)體免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著重要作用，鏈球菌最先在胸腺附近大量增殖，嚴(yán)重降低了機(jī)體的免疫能力，加劇了病變的進(jìn)程，從而造成頸部皮下組急性死亡，死亡率最高。腹腔接種途徑的致病性較高在于，直接接種腹腔內(nèi)，突破皮膚和粘膜屏障，直接在腹腔臟器大量增殖，對(duì)脾臟、肝臟、腎臟致病力較強(qiáng)。腹腔組反應(yīng)出，在養(yǎng)殖過(guò)程中注射不合格抗體或注射藥物操作不當(dāng)是鏈球菌感染的重要途徑之一。顱內(nèi)組作為接毒途徑致病力較弱，操作較困難，不適合作為人工復(fù)制鏈球菌感染雛雞實(shí)驗(yàn)的最佳途徑，后續(xù)研究應(yīng)避免使用這種接毒途徑。