摘要：目的 自制乙型肝炎病毒DNA室內(nèi)質(zhì)控血清并探討其在臨床標(biāo)本檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。方法 用檢測后的患者標(biāo)本自制陽性室內(nèi)質(zhì)控血清，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清HBV-DNA，記錄2013年1～5月質(zhì)控結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距、相關(guān)系數(shù)和相關(guān)結(jié)果的均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）及變異系數(shù)（cv）；結(jié)果 自制質(zhì)控物結(jié)果對數(shù)的累計(jì)數(shù)據(jù) x±2s范圍為4.3～5.34，在該質(zhì)控的參考值范圍內(nèi)；結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)室采用Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測HBV-DNA實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)控品穩(wěn)定性良好，可聯(lián)合運(yùn)用多參數(shù)同時(shí)監(jiān)測的質(zhì)控方法進(jìn)行，能保證為臨床提供有效可靠的準(zhǔn)確結(jié)果。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；室內(nèi)質(zhì)控；斜率；截距；相關(guān)系數(shù)

乙型肝炎屬于我國高發(fā)的流行性疾病。日前為止，我國慢性乙型肝炎病毒感染者約為1.3億，其中慢性乙型肝炎患者約5000萬例。HBV DNA定量檢測可反映病毒復(fù)制水平，主要用于慢性HBV感染的診斷、治療適應(yīng)證的選擇及抗病毒療效的判斷[1]。一般當(dāng)患者肝功波動(dòng)，轉(zhuǎn)氨酶升高，乙肝病毒復(fù)制指標(biāo)陽性，肝功處于代償階段的時(shí)候，抗病毒治療最為合適[2]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前核酸定量檢測較為理想和方便的方法之一，而Taqman探針技術(shù)的應(yīng)用更大大增加了探針的雜交穩(wěn)定性，使結(jié)果更精確、分辨率更高[3]。但其結(jié)果因反應(yīng)體系、系統(tǒng)誤差、檢測條件、人員等多種因素影響，易致結(jié)果的批內(nèi)、批間差異較大，因此需要好的質(zhì)控方法和質(zhì)控品保證結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。我室收集2013年1～5月對自制HBV-DNA陽性質(zhì)控血清檢測的質(zhì)控結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)結(jié)果的均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）及變異系數(shù)（cv）進(jìn)行累積數(shù)據(jù)評價(jià)，斜率、截距、相關(guān)系數(shù)結(jié)果分析如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 儀器為廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的DA7600熒光定量擴(kuò)增分析儀，試劑為該公司配套試劑。

1.2 質(zhì)控血清來源 選取日?；颊邿o溶血、無脂血、無黃疸的陽性血清標(biāo)本（乙肝病毒定量值104～105），收集標(biāo)本血清20ml，混勻，進(jìn)行HBV-DNA定量檢測，結(jié)果為6.93×104，對數(shù)值為4.84，在預(yù)期范圍內(nèi)。然后將血清分裝至0.5ml離心管中，每管0.1ml，保存于-20℃以下的冰箱，做為陽性質(zhì)控品。取其中20份進(jìn)行分次檢測，確定該質(zhì)控品結(jié)果對數(shù)靶值為4.99，標(biāo)準(zhǔn)差為0.22，變異系數(shù)為5.5%， x±s范圍為4.5～5.38。

1.3 試驗(yàn)方法 按試劑盒說明書進(jìn)行DNA模板提取，加入2μl至PCR反應(yīng)管中，與患者標(biāo)本及試劑盒自帶標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：93℃，2min；93℃，45s；55℃，60s；10個(gè)循環(huán)；93℃，30s；55℃，45s；30個(gè)循環(huán)。從第11循環(huán)開始檢測熒光信號。擴(kuò)增完成后進(jìn)行數(shù)據(jù)自動(dòng)分析，得到該次擴(kuò)增的質(zhì)控結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距、相關(guān)系數(shù)。

1.4 分析方法 將陽性質(zhì)控結(jié)果轉(zhuǎn)換為對數(shù)形式記錄，結(jié)合Levey-Jennings質(zhì)控圖和Westgard質(zhì)控規(guī)則進(jìn)行分析與判斷。使用EXCEL完成數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，對不同批號的檢測試劑質(zhì)控結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線三項(xiàng)參數(shù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)兩兩比較采用SPSS11.5進(jìn)行 χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 2013年1～5月的檢測結(jié)果累積數(shù)據(jù)分析（見表1）

質(zhì)控結(jié)果對數(shù)數(shù)值結(jié)果Levey-Jennings質(zhì)控圖（見圖1），結(jié)果顯示未有失控點(diǎn)。

2.2 不同批號質(zhì)控結(jié)果對比 不同批號檢測試劑的質(zhì)控結(jié)果的對數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距和相關(guān)系數(shù)各對應(yīng)結(jié)果的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)的 χ2檢驗(yàn)結(jié)果P>0.05，顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

乙肝熒光定量PCR技術(shù)是在PCR系統(tǒng)中加入帶有乙肝病毒DNA特殊位點(diǎn)的熒光標(biāo)記探針，以此來檢測患者體內(nèi)乙肝病毒DNA含量，具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)。現(xiàn)已在各醫(yī)院得到廣泛應(yīng)用，對疾病診斷、治療發(fā)揮著重要作用。目前多采用外標(biāo)法的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR，受模板濃度、PCR反應(yīng)體系的批內(nèi)、批間差異等影響較大[4]。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性仍需進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控活動(dòng)。室內(nèi)質(zhì)控是由實(shí)驗(yàn)室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，對影響檢驗(yàn)報(bào)告質(zhì)量的技術(shù)、管理、人員、儀器等因素予以有效的監(jiān)測和控制，保證實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確保臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)報(bào)告質(zhì)量符合要求、質(zhì)量體系有效運(yùn)行，確定測定結(jié)果是否可靠，可否發(fā)出報(bào)告。

在本研究中，我室通過質(zhì)控品對熒光定量PCR檢測標(biāo)本的批內(nèi)、批間一致性進(jìn)行監(jiān)測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對該次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可行性進(jìn)行判斷。標(biāo)準(zhǔn)曲線中的斜率反映了實(shí)驗(yàn)的靈敏度，截距指示實(shí)驗(yàn)中的空白值，相關(guān)系數(shù)代表了實(shí)驗(yàn)的精密度。斜率和截距的動(dòng)態(tài)趨勢圖可部分顯示實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)變化，相對質(zhì)控品的變異波動(dòng)小，均可反映實(shí)驗(yàn)情況和試劑動(dòng)態(tài)變化；相關(guān)系數(shù)反映X軸和Y軸的相關(guān)性，可用以評價(jià)擴(kuò)增是否有效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可用。通過對這三項(xiàng)系數(shù)的比較，能從另一方面衡量質(zhì)控結(jié)果的穩(wěn)定性。

我室采用的自制質(zhì)控血清，經(jīng)同行驗(yàn)證，具有質(zhì)量穩(wěn)定，精密度可靠的特點(diǎn)，無需特殊處理便可滿足PCR實(shí)驗(yàn)室HBV DNA檢測室內(nèi)質(zhì)量控制的需要[5]。由質(zhì)控圖中可以看出，整個(gè)分析時(shí)間段均無質(zhì)控結(jié)果超過3s，偶見有超過警告下限2s。分析原因，可能包括實(shí)驗(yàn)人員的操作差異，試劑批號差異，提取方法，質(zhì)控品保存溫度及系統(tǒng)偶然誤差等因素導(dǎo)致DNA模板丟失、擴(kuò)增效率降低、重復(fù)性低。我室采用實(shí)驗(yàn)人員的操作培訓(xùn)，進(jìn)一步規(guī)范實(shí)驗(yàn)室管理等措施后，質(zhì)控值回到靶值附近。通過分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的三項(xiàng)參數(shù)，可看出實(shí)驗(yàn)的結(jié)果具有可行性及穩(wěn)定性，且質(zhì)控對數(shù)值的波動(dòng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率及截距的波動(dòng)變化趨勢基本一致，說明了標(biāo)準(zhǔn)曲線對質(zhì)控值的影響，從而可以建立同時(shí)對質(zhì)控對數(shù)值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率及截距進(jìn)行同時(shí)監(jiān)測的質(zhì)控系統(tǒng)，增加整個(gè)室內(nèi)質(zhì)控系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

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