于俊媛，姜北，張驍鵬，黎庶，胡曉梅

第三軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，重慶 400038

細(xì)菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)的研究進(jìn)展

于俊媛，姜北，張驍鵬，黎庶，胡曉梅

第三軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，重慶 400038

細(xì)菌分泌系統(tǒng)參與細(xì)菌物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，是細(xì)菌蛋白或DNA胞外分泌的重要途徑，與細(xì)菌的生長(zhǎng)和致病性密切相關(guān)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了Ⅰ～Ⅶ型分泌系統(tǒng)。Ⅰ～Ⅵ型分泌系統(tǒng)存在于革蘭陰性菌中，其中Ⅳ型也存在于革蘭陽(yáng)性菌中;Ⅶ型則存在于革蘭陽(yáng)性菌中。Ⅶ型分泌系統(tǒng)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種特殊分泌系統(tǒng)，能介導(dǎo)病原微生物毒力蛋白分泌，與宿主相互作用，并參與細(xì)菌體內(nèi)鋅鐵平衡等，在革蘭陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)代謝及致病過程中發(fā)揮重要作用。本文綜述細(xì)菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)的類型、功能及表達(dá)調(diào)控，以增進(jìn)對(duì)這一新型細(xì)菌蛋白分泌機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

Ⅶ型分泌系統(tǒng);結(jié)核分枝桿菌;金黃色葡萄球菌;蛋白分泌;毒力

細(xì)菌分泌系統(tǒng)能介導(dǎo)生物大分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，與細(xì)菌的生存及致病性密切相關(guān)。致病菌通過分泌毒力因子等生物大分子在宿主體內(nèi)定植、繁殖、擴(kuò)散并致病，非致病菌通過分泌各種效應(yīng)分子以適應(yīng)環(huán)境變化。以往關(guān)于細(xì)菌分泌系統(tǒng)的研究主要集中于革蘭陰性菌，已發(fā)現(xiàn)并命名了Ⅰ～Ⅵ型分泌系統(tǒng)。與革蘭陰性菌相比，革蘭陽(yáng)性菌沒有結(jié)構(gòu)復(fù)雜的外膜，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單［1］，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制也不同。在革蘭陽(yáng)性菌，具有典型信號(hào)肽序列的蛋白可通過Sec途徑和Tat(雙精氨酸)途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。其中，Sec途徑主要介導(dǎo)未折疊蛋白的跨膜分泌，Tat途徑則介導(dǎo)折疊蛋白的分泌轉(zhuǎn)運(yùn)［2，3］。然而，革蘭陽(yáng)性菌分泌的部分蛋白不帶典型信號(hào)肽序列，不能通過Tat或Sec途徑進(jìn)行胞外轉(zhuǎn)運(yùn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一種特殊的細(xì)菌分泌系統(tǒng)參與了革蘭陽(yáng)性菌不含典型信號(hào)肽序列的蛋白跨膜運(yùn)輸，繼Ⅰ～Ⅵ型分泌系統(tǒng)之后被命名為Ⅶ型分泌系統(tǒng)(typeⅦsecretion system，T7S system，T7SS)。

1 T7SS的發(fā)現(xiàn)及類型

T7SS是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌分泌系統(tǒng)，鑲嵌于革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞膜中，最先在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁最外層具有高度疏水、幾乎不通透的分枝菌酸膜，而蛋白分泌要跨越分枝菌酸膜就需要一種特殊的蛋白分泌系統(tǒng)。通過比較致病性結(jié)核分枝桿菌與減毒卡介苗的基因組，發(fā)現(xiàn)RD1序列的缺失是導(dǎo)致其蛋白分泌及毒力差異的遺傳學(xué)原因。對(duì)RD1序列的研究發(fā)現(xiàn)，其編碼蛋白構(gòu)成一個(gè)蛋白分泌系統(tǒng)，命名為 T7SS［4，5］。序列比對(duì)顯示，在金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白喉棒狀桿菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌、無乳鏈球菌等致病性革蘭陽(yáng)性菌的基因組中，均有類似的T7SS編碼基因存在(圖1)［6］;恥垢分枝桿菌［7］、海洋分枝桿菌［8］等非致病性分枝桿菌中也存在T7SS相關(guān)基因的同源結(jié)構(gòu)。隨著研究的深入，在鏈霉菌屬的植物病原菌瘡痂病鏈霉菌［9］和天藍(lán)色鏈霉菌［10］中也發(fā)現(xiàn)了類似的分泌系統(tǒng)存在。

分枝桿菌T7SS為由多個(gè)6 kDa早期分泌性抗原靶(6 kDa early secretory antigenic target，ESAT-6)家族基因串聯(lián)而成的基因簇，其中有5個(gè)同源的大基因座，分別命名為ESX-1(Rv3866～Rv3883c)、ESX-2(Rv3884c～Rv3895c)、ESX-3(Rv0282～Rv0292)、ESX-4(Rv3444c～Rv3450c)和 ESX-5(Rv1782～Rv1798)(圖2)。進(jìn)化分析得知，這5種不同的基因簇是通過基因復(fù)制形式產(chǎn)生的，產(chǎn)生的先后順序是ESX-4、ESX-1、ESX-2、ESX-3、ESX-5［11］。其中，發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入的是ESX-1，因其參與結(jié)核分枝桿菌毒力因子ESAT-6的分泌而受到關(guān)注。ESX-5主要與脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸(proline-proline-glutamic acid，PPE)蛋白的分泌相關(guān);ESX-3涉及分枝桿菌中的鋅鐵平衡;而ESX-2和ESX-4的功能至今尚不清楚。

圖1 不同種屬的T7SS基因結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig.1 Genetic structures of T7SS in different species

圖2 ESX-1～ESX-5基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Genetic structures of ESX-1to ESX-5

金黃色葡萄球菌基因組中也存在與結(jié)核分枝桿菌ESX基因同源的基因簇，包括8個(gè)基因(圖3)，編碼膜蛋白成分(如EssA、EssB、EssD)、效應(yīng)分子(如EsxA、EsxB)及一些與 EsxA、EsxB分泌相關(guān)的蛋白。

圖3 已知金黃色葡萄球菌ESS系統(tǒng)編碼基因Fig.3 Known coding genes of ESS system in S.aureus

2 T7SS的功能

研究表明，T7SS與細(xì)菌毒力相關(guān)蛋白分泌、DNA傳遞、細(xì)菌鋅鐵平衡等功能相關(guān)。

2.1 分泌毒力相關(guān)蛋白

2.1.1 WXG100蛋白家族WXG100蛋白家族由長(zhǎng)度約100個(gè)氨基酸的蛋白組成，因其區(qū)域中心具有保守的WXG(Try-X-Gly)氨基酸序列結(jié)構(gòu)域而得名。該蛋白家族廣泛存在于革蘭陽(yáng)性菌中，其編碼基因多位于ESX基因簇上，是T7SS的典型分泌底物。

目前WXG100家族中研究最為廣泛的是結(jié)核分枝桿菌的毒力因子ESAT-6和培養(yǎng)濾過蛋白10 (culture filtrate protein 10，CFP-10)，由ESX-1系統(tǒng)分泌出胞，敲除 ESX-1基因座會(huì)導(dǎo)致 ESAT-6和CFP-10分泌阻斷，細(xì)菌毒力衰減。ESAT-6和CFP-10在分泌時(shí)形成異源二聚體，兩者的分泌相互依賴［12］。在結(jié)核分枝桿菌侵染巨噬細(xì)胞過程中，巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)受到擾動(dòng)而形成泡沫現(xiàn)象。胞內(nèi)泡沫可作為結(jié)核分枝桿菌的營(yíng)養(yǎng)來源并形成利于細(xì)菌生存的環(huán)境。ESAT-6能介導(dǎo)這一反饋循環(huán)［13］。Simeone等［14］研究發(fā)現(xiàn)，ESAT-6在結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮功能，而ESAT-6的C端截短導(dǎo)致毒力衰減，表明在結(jié)核分枝桿菌引起宿主細(xì)胞壞死過程中，ESAT-6的C端起重要作用［15］。另外，在結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)及體外感染巨噬細(xì)胞過程中，ESX-1還可通過誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素﹝α干擾素(interferon α，IFN-α)及IFN-β﹞［16］和Ⅱ型干擾素(IFN-γ)［17］的產(chǎn)生影響巨噬細(xì)胞的代謝活動(dòng)來操控宿主的免疫反應(yīng)，引起巨噬細(xì)胞壞死，敲除實(shí)驗(yàn)證明這一過程依賴ESAT-6/CFP-10的參與。這些研究表明，在結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞過程中，ESX-1及其分泌蛋白ESAT-6對(duì)宿主細(xì)胞的代謝具有調(diào)控作用，而這種調(diào)控對(duì)結(jié)核分枝桿菌侵染宿主細(xì)胞起重要作用。

在金黃色葡萄球菌中，與ESAT-6和CFP-10同源的蛋白是EsxA和EsxB。EsxA和EsxB也包含WXG結(jié)構(gòu)域，屬于WXG100蛋白家族，合成后通過T7SS轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外而發(fā)揮功能。EsxA與金黃色葡萄球菌感染過程中膿腫的形成有關(guān)［18］。純化的EsxA蛋白可作為抗原來檢測(cè)金黃色葡萄球菌感染患者血清中的EsxA抗體，提示EsxA可用作制備疫苗的抗原［19］。與結(jié)核分枝桿菌中ESAT-6和CFP-10共同分泌方式一樣，金黃色葡萄球菌中EsxB與EsxA的合成與分泌也是相互依賴的。曾有人推測(cè)EsxB與EsxA也能相互作用形成異二聚體;但 Anderson等［20］研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌T7SS的非典型底物EsxC和EsxD(不屬于WXG100蛋白家族)分別能與EsxA、EsxB相互作用形成復(fù)合物，EsxC和EsxA還能自身聚合形成復(fù)合物，而EsxA和EsxB并不能聚合，表明EsxA與EsxB之間分泌的相關(guān)性并非源自它們的直接相互作用，或許有其他分泌因子參與和協(xié)同，但具體分子機(jī)制尚不清楚。

在對(duì)結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌及其他種屬細(xì)菌WXG100蛋白家族的研究中發(fā)現(xiàn)，這種分泌蛋白之間相互聚合形成復(fù)合物的現(xiàn)象廣泛存在，但這些聚合蛋白之間并不存在明顯的序列同源性，而表現(xiàn)出一定肽段折疊方式的相似性。因此，人們推測(cè)分泌蛋白之間的相互作用可能是因?yàn)槟承┍Ｊ亟Y(jié)構(gòu)基序的存在，但具體是哪種結(jié)構(gòu)基序參與其中，尚有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，這種序列多樣性可能與感染過程中病原菌的免疫逃逸相關(guān)。

2.1.2 脯氨酸-谷氨酸/PPE蛋白脯氨酸-谷氨酸(proline-glutamic acid，PE)/PPE蛋白家族以其特有的P-E、P-P-E序列而命名，還具有多個(gè)N端重復(fù)序列。PE/PPE蛋白家族是分枝桿菌特有的，在結(jié)核分枝桿菌和海洋分枝桿菌等病原菌中的表達(dá)量較高。PE/PPE蛋白家族的生理學(xué)功能目前還不清楚，研究表明這一家族的某些成員在宿主-病原體相互作用和發(fā)病機(jī)制等方面發(fā)揮功能［21-24］。在分枝桿菌中，PE/PPE家族的蛋白是通過 ESX-5分泌的［25］。研究證明，一種特殊的PPE蛋白——PPE2 (Rv0256c)能阻止活化巨噬細(xì)胞中一氧化氮(nitric oxide，NO)(NO及其副產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌具有毒性)的產(chǎn)生，細(xì)菌可能通過誘導(dǎo)PPE2蛋白表達(dá)阻止侵染細(xì)胞過程中產(chǎn)生過量NO來實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)［26］。

2.2 參與細(xì)菌間DNA的傳遞

與T4SS一樣，T7SS不僅能參與革蘭陽(yáng)性菌的蛋白分泌，還參與細(xì)菌間DNA的傳遞。在恥垢分枝桿菌接合作用中，通過構(gòu)建供體菌轉(zhuǎn)座子插入突變體庫(kù)研究DNA轉(zhuǎn)移調(diào)控因子時(shí)發(fā)現(xiàn)，插入突變體的突變位點(diǎn)是相對(duì)集中的，多位于RD1區(qū)域，而突變體接合作用頻率顯著增加，表明在恥垢分枝桿菌接合作用中ESX-1起負(fù)調(diào)節(jié)作用［27］。然而，在受體菌轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)篩選過程中發(fā)現(xiàn)，接合作用缺陷突變體多在ESX-1或與之相關(guān)的區(qū)域發(fā)生突變，證明ESX-1在受體菌中的作用與在供體菌中相反，有促進(jìn)作用［28］。

2.3 維持體內(nèi)鋅鐵平衡

不同于ESX-1和ESX-5，ESX-3通過影響細(xì)菌的鋅鐵平衡與細(xì)菌的體外生長(zhǎng)和發(fā)育密切相關(guān)。鐵是多種酶的輔因子，還與電子傳遞及氧代謝相關(guān)，而過量的鐵和鋅對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)是有毒性的，因此鋅和鐵的攝入調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)菌的正常生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要作用。結(jié)核分枝桿菌ESX-3的轉(zhuǎn)錄與IdeR(鐵依賴阻遏物)和Zur(鋅吸收調(diào)控蛋白)的表達(dá)密切相關(guān)，對(duì)應(yīng)不同的鐵和鋅濃度而受到調(diào)節(jié)，因此推測(cè)ESX-3與分枝桿菌胞內(nèi)二價(jià)陽(yáng)離子特別是體內(nèi)鐵和鋅平衡相關(guān)［29］。在恥垢分枝桿菌中，ESX-3的調(diào)節(jié)與鐵濃度的變化相關(guān)［30］。Serafini等構(gòu)建的結(jié)核分枝桿菌ESX-3條件突變株只能在高濃度鋅和鐵的條件下及野生株的培養(yǎng)上清液中生長(zhǎng)，表明結(jié)核分枝桿菌中ESX-3與鋅鐵攝入的調(diào)節(jié)相關(guān)［31］。最近，Loots等［32］應(yīng)用代謝組學(xué)方法比較恥垢分枝桿菌ESX-3敲除株與野生株的代謝情況，鐵在ESX-3敲除株中積累，這可能是因?yàn)镋SX-3敲除株中鐵攝入相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)ESX-3敲除導(dǎo)致鐵蛋白合成增加或參與細(xì)胞內(nèi)多余鐵的輸出。ESX-3可能通過對(duì)鋅鐵平衡的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)對(duì)分枝桿菌體外生長(zhǎng)的影響。

2.4 其他功能

T7SS除參與細(xì)菌毒力相關(guān)蛋白分泌、DNA傳遞及調(diào)節(jié)細(xì)菌鋅鐵平衡外，還有一些其他功能。例如，在鏈霉菌屬的植物病原菌瘡痂病鏈霉菌［9］和天藍(lán)色鏈霉菌［10］的研究中發(fā)現(xiàn)，T7SS分泌產(chǎn)物EsxA/B與其生長(zhǎng)周期及孢子的發(fā)育形成有關(guān)，但敲除瘡痂病鏈霉菌T7SS組分對(duì)其致病性沒有影響。另外，T7SS與產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的毒力也沒有相關(guān)性［33］。從進(jìn)化角度講，出現(xiàn)T7SS與毒力不相關(guān)的現(xiàn)象可能是由于T7SS最初產(chǎn)生并不是參與毒力因子分泌，只是在進(jìn)化過程中獲得了分泌毒力因子的功能［34］。

3 T7SS的調(diào)控相關(guān)基因

近年來研究表明，T7SS的功能發(fā)揮受構(gòu)成性基因簇外基因元件的調(diào)控。

3.1 ESX-1功能的調(diào)節(jié)

3.1.1 espA-espC-espD基因簇在分枝桿菌中，espA-espC-espD(Rv3616c-Rv3615c-Rv3614c)基因簇與ESX-1基因簇在基因組中不相鄰，但能影響ESX-1功能的發(fā)揮。espA-espC-espD基因簇編碼的分泌性蛋白為 EspA(Rv3616c)、EspC(Rv3615c)和EspD(Rv3614c)。其中，EspA經(jīng)ESX-1分泌并與ESAT-6的分泌相互依賴，EspC包含一段EspA和ESAT-6分泌必需的信號(hào)序列，EspD能使細(xì)胞內(nèi)EspA和EspC水平保持穩(wěn)定［35］。對(duì)結(jié)核分枝桿菌EspA蛋白的氨基酸殘基突變研究顯示，EspA多個(gè)位點(diǎn)氨基酸殘基的置換會(huì)導(dǎo)致ESAT-6及CFP-10的分泌受阻并引起細(xì)菌毒力變化，但不同氨基酸殘基對(duì)EspA功能的影響有所不同［36］。

3.1.2 MprAB雙組分系統(tǒng)MprAB雙組分系統(tǒng)包括反應(yīng)調(diào)節(jié)子MprA和組氨酸激酶MprB，與結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染過程相關(guān)，并參與結(jié)核分枝桿菌脅迫應(yīng)答［37］。espA基因簇中的幾個(gè)基因形成一個(gè)操縱子，在espA啟動(dòng)子中存在幾個(gè)MprA結(jié)合位點(diǎn)。MprA對(duì)espA操縱子有抑制作用，mprAB基因敲除可導(dǎo)致espA及其下游基因過表達(dá)［38］。與野生株相比，mprAB突變株(Rv-D981)ESX-1功能異常，EspA和ESAT-6的分泌顯著減少［39］。這些實(shí)驗(yàn)證明，MprAB雙組分系統(tǒng)可通過直接影響espA基因簇的表達(dá)而間接調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌ESX-1功能。

3.1.3 其他與ESX-1相關(guān)的調(diào)節(jié)子除對(duì)ESX-1有直接作用的espA-espC-espD基因簇和起間接調(diào)節(jié)作用的MprAB雙組分系統(tǒng)外，ESX-1還受其他調(diào)節(jié)子的調(diào)控。EspR能結(jié)合espA啟動(dòng)子，激活espA操縱子轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)ESX-1轉(zhuǎn)錄。espR缺失導(dǎo)致espA操縱子及ESX-1轉(zhuǎn)錄降低，ESAT-6分泌喪失，毒性降低［40］。PhoPR雙組分系統(tǒng)也具有激活espA操縱子的功能;PhoPR還能感知低pH值，與espA操縱子在酸性條件下表達(dá)上調(diào)相關(guān)［41］。另外，CAMP受體蛋白(CAMP receptor protein，CRP)和核酸相關(guān)蛋白Lsr2也能抑制espA操縱子的轉(zhuǎn)錄［42，43］。

3.2 金黃色葡萄球菌中ESX分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)

EsxA是由金黃色葡萄球菌ESX分泌系統(tǒng)分泌的毒力相關(guān)因子。最近有研究表明，esxA轉(zhuǎn)錄受一個(gè)與σB相關(guān)的級(jí)聯(lián)單位的調(diào)節(jié)，該級(jí)聯(lián)單位包含副調(diào)節(jié)子SarA、雙組分系統(tǒng)ArlRS和SpoVG。SarA或σB失活條件下，esxA轉(zhuǎn)錄上調(diào)，但在 arlR和spoVG突變體中表達(dá)受抑制，表明SarA或σB抑制esxA表達(dá)，而ArlR和SpoVG則對(duì)esxA轉(zhuǎn)錄起促進(jìn)作用。SpoVG是一個(gè)σB依賴元素，通過抵消σB引起的SarA活動(dòng)抑制esxA轉(zhuǎn)錄［44］。另外，在agr基因突變株中，esxA轉(zhuǎn)錄減少，但這種轉(zhuǎn)錄量降低對(duì)其他esx基因簇相關(guān)基因的表達(dá)情況目前還沒有報(bào)道。

4 結(jié)語(yǔ)

革蘭陽(yáng)性菌T7SS是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌分泌系統(tǒng)。目前，對(duì)這一新型分泌系統(tǒng)的研究主要集中在一些重要的病原微生物，如結(jié)核分枝桿菌的ESX-1和ESX-5、金黃色葡萄球菌的ESS系統(tǒng)等方面。相關(guān)研究大多處于初級(jí)階段，對(duì)其認(rèn)識(shí)極其有限。T7SS確切的亞基組成、行使蛋白外排功能的具體機(jī)制及其在細(xì)菌生長(zhǎng)與繁殖及致病中的作用等均有待深入研究。這些研究結(jié)果不僅促進(jìn)人們對(duì)結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性菌生長(zhǎng)和代謝及致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，還可為相應(yīng)感染性疾病的預(yù)防、診斷及新藥物的開發(fā)提供新思路及潛在靶標(biāo)。

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Bacterial typeⅦ secretion system

YU Jun-Yuan，JIANG Bei，ZHANG Xiao-Peng，LI Shu，HU Xiao-Mei
Department of Microbiology，The Third Military Medical University，Chongqing 400038，China

Bacterial secretion systems are responsible for the secretion of bacterial produced moleculars or DNA，and closely related to the growth and pathogenicity of bacteria.So far，seven types of secretion systems have been identified.TypesⅠ-Ⅵ exist in Gram-negatives and typesⅣ andⅦ exist in Gram-positives.TypeⅦ secretion system(T7SS)is identified recently.It is involved in the secretion of virulence-associated proteins，the interaction between pathogens and hosts，and the balance of zinc/iron ions，and is implicated in growth and pathogenesis of Gram-positive bacteria.The classification，regulation and biological functions of T7SS are reviewed in the present paper.

Type Ⅶ secretion system; Mycobacterium tuberculosis; Staphylococcus aureus; Protein secretion;Virulence

.HU Xiao-Mei;E-mail:hxmay2008@163.com

2014-06-16)

重慶市自然科學(xué)基金(cstc2011jjA10050、CSTC 2011BB5026)

胡曉梅