楊俐萍，朱順星，閔婭蘭，劉煥良，錢紅燕，陳櫞，朱菁燁，邵晶晶，雒潤華，李靜，段瑞冬

（1.南通大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所中心實驗室，江蘇南通 226361；2.南通大學實驗動物中心，江蘇南通 226001；3.瑞典LUND大學胃腸營養(yǎng)實驗室，LUND瑞典，S-22184）

研究報告

堿性鞘磷脂酶基因剔除鼠的基因型和表型特征

楊俐萍1*，朱順星2，閔婭蘭1，劉煥良1，錢紅燕1，陳櫞1，朱菁燁1，邵晶晶1，雒潤華1，李靜1，段瑞冬3

（1.南通大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所中心實驗室，江蘇南通 226361；2.南通大學實驗動物中心，江蘇南通 226001；3.瑞典LUND大學胃腸營養(yǎng)實驗室，LUND瑞典，S-22184）

目的為研究alk-SMase在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供動物模型的實驗數(shù)據(jù)。方法將野生型（WT，+/+）、雜合子（+/ˉ）、純合子（KO，ˉ/ˉ）alk-SMase基因剔除小鼠剪尾提取DNA，PCR法作基因型鑒定；取其肝腸組織進行HE染色、激光共聚焦分析以及質(zhì)譜儀檢測，觀察和分析不同基因型鼠的表型特征。結(jié)果與WT和雜合子比較，KO鼠顯示：外觀和體重無明顯區(qū)別；基因型鑒定出現(xiàn)一個條帶，其分子量為247 bp；小腸黏膜明顯增厚，但alk-SMase表達減弱；質(zhì)譜分析顯示在腸道和肝臟中的鞘磷脂含量增高，1-磷酸鞘氨醇含量增加，而神經(jīng)酰胺含量降低。結(jié)論alk-SMase KO鼠有明顯特征，但其外觀和體重與其他基因型比較沒有明顯區(qū)別，為研究alk-SMase的生物功能提供了一個理想的動物模型。

堿性鞘磷脂酶；基因剔除小鼠；基因型；表型

堿性鞘磷脂酶（alkaline sphingomyelinase，alk-SMase）是腸道中鞘磷脂代謝的關(guān)鍵酶，其通過水解鞘磷脂（sphingomyelin，SM）產(chǎn)生一系列生物活性物質(zhì)，如神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）和1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-P，S1P）來調(diào)控細胞的生長、凋亡及炎癥反應(yīng)［1，2］。近年來，隨著對alk-SMase的深入研究，特別是alk-SMase基因剔除（konckout，KO）鼠模型的成功建立［3］，人們對此酶在生理病理方面的作用有了更進一步的理解，發(fā)現(xiàn)它在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的研究中起著重要的工具作用［4］。然而，對經(jīng)過轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生的alk-SMase KO鼠本身的特征尚未見有全面的報道。為了闡明alk-SMase KO鼠的背景特征，使該模型能更好地應(yīng)用于alk-SMase功能及其在腫瘤中作用的研究，我們從瑞典隆德大學實驗動物中心（瑞典隆德大學段瑞冬教授惠贈）引進了alk-SMase KO雜合子小鼠，在南通大學SPF實驗動物中心飼養(yǎng)繁殖，并對其仔鼠進行基因鑒定和表型分析。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5只雜合子、3只純合子alk-SMase KO鼠，其中有4只雄性和4只雌性，來源于瑞典LUND大學實驗動物中心（2012年由段瑞冬教授惠贈），經(jīng)中國海關(guān)安全檢查后入駐南通大學SPF動物中心，并飼養(yǎng)繁殖。該小鼠遺傳背景為C57BL/6，近交系，由南通大學實驗動物中心提供【SCXK（蘇）2014ˉ0001】。動物的飼養(yǎng)繁殖以及實驗在南通大學實驗動物中心進行【SYXK（蘇）2012ˉ0031】，并通過南通大學實驗動物倫理委員會的審批，批準號為NTU-KO-2012-009。

1.2 飼養(yǎng)和繁殖

按照SPF級動物飼養(yǎng)標準進行飼養(yǎng)，實行自由采食和飲水。采用1對1雌雄鼠“長期同居”方式進行繁殖。母鼠孕期為19～21 d，哺乳期為18～23 d。在幼鼠3周齡時，斷奶分籠，打標記并進行基因鑒定。

1.3 基因型鑒定

1.3.1 組織DNA的提取

將小鼠尾部組織小段（長約0.5～1.0 cm）置入1.5 mL Eppendorf管中，參照Fermentas的Fast tissue-to-PCR試劑盒（Thermo，美國）抽提DNA。

1.3.2 PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳基因型鑒定

引物設(shè)計參照相關(guān)文獻［3］，上游引物：5’-CTGCCACTTTACACTGGTCAC，下游引物：5’-TGGCACTGAGGCGAGAAC。PC儀循環(huán)擴增反應(yīng)條件：95℃10 min預(yù)變，95℃30s變性，55℃30s退火，72℃1min延伸，共35個循環(huán)。電泳鑒定：分別取10μL PCR擴增產(chǎn)物及DNA ladder（Thermo，美國）加載在含40μL GelRed的1.0%瓊脂糖凝膠中，經(jīng)100V 30 min電泳后置于凝膠成像儀ChemiDocXRS +（Bio-Rad，美國）觀察拍照。

1.4 表型觀察和分析

1.4.1 外觀及體重

定期觀察野生型（wild type，WT）、雜合子，KO三種不同基因型小鼠毛色及測量體重的變化。

1.4.2 組織切片HE染色

取25周齡的三種不同基因型的小鼠各5只鼠的小腸、大腸、肝臟，將組織置于4%多聚甲醛固定中固定，按常規(guī)病理標本制備方法進行石蠟包埋、切片以及蘇木精和伊紅（HE）染色，顯微鏡攝像分析。

1.4.3 激光共聚焦分析

制備小腸新鮮冰凍切片標本：組織標本經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜后，用30%蔗糖脫水6 h以上，OCT包埋。采用冰凍切片機（Leica，德國）按6μm厚度切片。依照免疫熒光染色方法對切片染色：經(jīng)10%牛血清白蛋白封閉后加入抗alk-SMase抗體（瑞典LUND大學段瑞冬教授贈）4℃過夜，PBS漂洗3次后加入熒光二抗（驢抗兔-FITC綠色熒光）室溫40 min，經(jīng)PBS漂洗3次后封片，激光共聚焦攝像分析。

1.5 質(zhì)譜儀檢測

取7～10只14～16周齡WT及KO鼠，安樂死后快速取其小腸、大腸、肝臟器官組織，用4℃PBS沖洗內(nèi)容物后，將組織放在液氮中研磨成粉末狀，ˉ 80℃中保存。按照參考文獻［5］的方法提取磷脂并采用質(zhì)譜儀（Applied Biosystems，美國）測定其代謝產(chǎn)物的含量（由中科院化學研究所測定）。

2 結(jié)果

2.1 基因型鑒定

取3周齡仔鼠尾部組織DNA進行PCR擴增顯帶，3種基因型的條帶顯示見圖1：m1、m2只出現(xiàn)732 bp條帶，為WT（+/+）；m3、m5出現(xiàn)732 bp和247 bp兩個條帶，為雜合子型（+/ˉ）；m4、m6、m7只出現(xiàn)247 bp條帶，為KO型（ˉ/ˉ）。

注：m1～m7為小鼠尾部組織DNA樣本，M：DL3000分子量標記，DNA分子分別顯示在732 bp和247 bp條帶上。+/+為WT，+/ˉ為雜合子型，ˉ/ˉ為KO。圖1 alk-SMase WT、雜合子和KO的基因型PCR鑒定Note.m1ˉm7 represent the tail DNA samples derived from the offspringmice of alk-SMase KO.M，DL3000DNA ladder. On the gel there are two bands，732 bp and 247 bp，+/+ wild type，+/ˉheterozygous，ˉ/ˉhomozygous.Fig.1 alk-SMase genotyping by PCR

2.2 小鼠的生長、外觀及體重變化

母鼠孕期19～21 d，每胎產(chǎn)仔6～10只，仔鼠成活率＞95%，成熟期；雄性10周，雌性8周。KO和雜合子型與同窩WT小鼠比較，毛色正常，外觀和體重上未見明顯差異（見圖2）。

2.3 組織形態(tài)學特征

顯微鏡下觀察不同基因型鼠的腸壁及肝組織的HE染色切片，發(fā)現(xiàn)：WT和雜合子的腸黏膜、肝組織均無明顯區(qū)別，而KO小腸黏膜有明顯增厚，幾乎為WT的3倍（圖3右上），但其結(jié)直腸黏膜及肝組織的形態(tài)則無明顯差別（見圖3）。

2.4 alk-SM ase蛋白的熒光表達

將帶有綠色熒光標記的抗alk-SMase抗體對不同基因型鼠的腸黏膜進行免疫熒光染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察到：WT腸黏膜上的alk-SMase表達是顯而易見的，而雜合子和KO腸黏膜上的alk-SMase表達量均下降，在KO腸黏膜上的表達幾乎消失（見圖4）。

注：A.正面像，左側(cè)鼠為WT（+/+），右側(cè)鼠為KO（ˉ/ˉ）；B.背面像，左側(cè)鼠為WT（+/+），右側(cè)鼠為KO（ˉ/ˉ）。與WT比較，KO小鼠毛色正常，體重無明顯差異。圖2 alk-SMase KO與WT鼠外觀形態(tài)的比較Note.A，B：Photos taken from frontand back of themice，wild-type（+/+）on the left，homozygous（ˉ/ˉ）on the right in each photo.Among the same age littermates there are no differences in the appearance and body weight regardless of genotype.Fig.2 Gross appearance of the alk-SMase KOmice

2.5 鞘脂代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜分析

SM在alk-SMase的酶解作用下生成Cer，繼而產(chǎn)生S1P的代謝產(chǎn)物。利用微量敏感的質(zhì)譜儀測定alk-SMase KO鼠的腸道黏膜和肝組織中的鞘磷脂代謝產(chǎn)物含量，結(jié)果顯示，①SM的含量變化：雖然與WT比較沒有統(tǒng)計學的顯著差異，但在KO鼠的小腸、結(jié)直腸黏膜以及肝組織中的SM含量均有所增加，分別增加35 pmoL/mg（8%），34 pmoL/mg（6%），29 pmoL/mg（6%）；②Cer的含量變化：在KO鼠的小腸、結(jié)直腸黏膜以及肝組織中的Cer含量均降低，分別降低38 pmoL/mg（18%），24 pmoL/mg（13%），4 pmoL/mg（3%），其中小腸黏膜的Cer含量減少與WT比較有顯著的統(tǒng)計學差異，P＜0.05。③S1P的含量變化：在KO鼠的小腸、結(jié)直腸黏膜以及肝組織中的S1P含量明顯增加，分別增加14 fmoL/mg（38%），13 fmoL/mg（34%），5 fmoL/mg（18%），其中腸黏膜的S1P含量增加與WT比較有顯著的統(tǒng)計學差異，P＜0.05（見圖5）。

注：HE染色圖片代表來自10只不同基因型鼠組織。bar=250μm。圖3 不同基因型小鼠肝腸組織形態(tài)學比較，×200Note.Representativemicrographs of HE stained slideswere taken from 10 littermates of identified genotypes ofmice，respectively.The bars inserted in the images indicate 250μmFig.3 Morphological comparison among 3 types of genotype of alk-SMase KO mice

注：免疫熒光染色圖片代表WT（+/+）、雜合子（+/ˉ）及KO（ˉ/ˉ）不同基因型鼠的腸壁組織。綠色為alk-SMase蛋白，藍色為細胞核（DAPI陽性）。在KO（ˉ/ˉ）腸黏膜上alk-SMase的表達明顯減弱。標尺100μm。圖4 alk-SMase在不同基因型鼠腸黏膜上的表達，×400Note.Representativemicrographs of alk-SMase immunofluorescence staining from the littermates of identified genotypes with WT（+/+），heterozygous（+/ˉ）and KO（ˉ/ˉ），respectively.Green color indicates positive alk-SMase expression，and blue indicates cellnuclei（DAPI+）.The alk-SMase expression was down-regulated in KO（ˉ/ˉ）intestine.The bars inserted in the images indicate 100μm，×400Fig.4 alk-SMase expression in the intestinalmucosa of identified genotype ofmice.

注：A、B、C分別為在小腸、結(jié)直腸、肝臟中鞘磷脂代謝物SM、Cer、S1P含量的質(zhì)譜儀分析統(tǒng)計圖，其中SM和Cer的值來自WT（+/+）及KO（ˉ/ˉ）各10只（n=10），S1P的值來自WT及KO各7只（n=7），3次獨立的實驗。柱形圖代表平均值±標準誤，*P＜0.05。圖5 alk-SMase KO鼠肝腸組織中鞘磷脂代謝產(chǎn)物含量的質(zhì)譜儀分析Note.The histograms in A，B，C represent the levels of sphingolipids metabolites SM，Cer，S1P in the intestine and liver tissues of alk-Mase WT（+/+）and KO（ˉ/ˉ）mice，which were detected by mass spectrometry.Analysis data were from n=10 in both SM group and Cer group，respectively，n=7 in S1P group，respectively.3 independent experiments，mean±SEM，*P＜0.05.Fig.5 SM，Cer，S1P levels detected by MS in the intestine and liver ofWT and KOmice

3 討論

早在1969年瑞典醫(yī)學家尼爾森就發(fā)現(xiàn)腸道中存在alk-SMase酶［6］，然而直到20世紀90年代才被廣泛研究，2011年才見有alk-SMase基因剔除鼠模型的報道［3］。研究表明，alk-SMase的特性具有①組織表達特異性，alk-SMase僅分布于腸道微絨毛膜上（除人的膽汁外）；②膽汁鹽依賴性，其酶活性需要膽鹽的存在；③胰酶消化抵抗性，這就保護了酶的高穩(wěn)定性等［1］。alk-SMase最主要的功能是水解SM，腸腔內(nèi)SM在alk-SMase酶作用下水解成Cer，Cer又在神經(jīng)酰胺酶的作用下進一步水解成鞘氨醇（sphingosine，Sph），Sph在鞘氨醇激酶作用下磷酸化成S1P。Cer、S1P有第二信使的作用，兩者的平衡調(diào)節(jié)參與了調(diào)控細胞的增生、凋亡，抗炎、新生血管形成等過程［7，8］。近年研究表明，alk-SMase基因剔除鼠化學性誘發(fā)結(jié)腸癌的發(fā)生率高于野生型［4］，提示alk-SMase在結(jié)腸炎和結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

雖然alk-SMase基因剔除鼠已被用于研究，但該動物本身的背景特征尚需闡明，這對于今后研究結(jié)腸癌發(fā)生的誘因、病理機制和抗癌藥的使用是很有必要的?；谶@個目的，我們從瑞典隆德大學引進了alk-SMase基因剔除的小鼠，并在SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)繁殖，利用形態(tài)學方法、PCR以及質(zhì)譜儀技術(shù)對動物的子代進行基因鑒定，表型觀察以及代謝物含量的測定，發(fā)現(xiàn)從外觀、毛色和體重看，KO與WT小鼠沒有區(qū)別，但它們的基因型和腸道表型有明顯的區(qū)分。KO鼠因在alk-SMase基因上剔除了一個外顯子，使序列長度減少，所以基因鑒定條帶上的分子量比WT的?。?］，導致alk-SMase在腸道的表達下調(diào)。由于alk-SMase缺失引起SM的消化障礙，出現(xiàn)抗細胞增殖和促凋亡的Cer生成減少，而與Cer相抗衡的S1P增多，導致腸道細胞增生，腸壁增厚（這點在我們的HE染色結(jié)果中得到證實），甚至誘發(fā)癌癥［4］。

綜上所述，alk-SMase KO鼠有明顯的alk-SMase功能缺失背景，在無誘因之下，不影響鼠的一般健康狀態(tài)，與正常鼠相似，但是它們可能是結(jié)腸癌發(fā)生的易感高危鼠群。因此，本研究通過實驗闡明了alk-SMase KO鼠的特征，為進一步利用該動物模型作為研究工具，對alk-SMase的功能尤其是在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制的探討提供了有價值的實驗數(shù)據(jù)。

［1］ Duan RD.Alkaline sphingomyelinase：An old enzyme with novel implications［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1761（3）：281 ˉ291.

［2］ 雒潤華，楊俐萍.堿性鞘磷脂酶在結(jié)腸癌中作用的研究進展［J］.交通醫(yī)學，2013，27（4）：319ˉ322.

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［4］ Chen Y，Zhang P，Xu S，et al.Enhanced colonic tumorigenesis in alkaline sphingomyelinase（NPP7）knockoutmice［J］.Mol Cancer Ther，2015，14（1）：259ˉ267.

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Genotypic and phenotypic characteristics of alkaline sphingom yelinase knockoutm ice

YANG Li-ping1*，ZHU Shun-xing2，Min Ya-lan1，LIU Huan-liang1，QIAN Hong-yan1Chen Yuan1，Zhu Jing-ye1，Shao Jing-jing1，LUO Run-hua1，LIJing1，Duan Rui-dong3
（1.Key Laboratory，Cancer Research Center，Nantong University，Nantong Juangsu 226361，China；2.Animal Research Facility in Nantong University，Nantong Juangsu 226001；3.Gastroenterology&Nutrition Laboratory，Lund University，Lund，Sweden S-22184）

ObjectiveTo determine the genotypic and phenotypic characteristics of alkaline sphingomyelinase（alk-SMase）knockout（KO）mice and to provide the foundation data of this animalmodel for further study of the role of alk-SMase in colon cancer.M ethodsDNA was extracted from the tail tissue ofwild type，heterozygous，homozygous KO mice，respectively.PCR analysis was used for genotyping.HE staining，confocalmicroscopy，and mass spectrometry were used for the detection ofmorphology，alk-SMase expression and sphingolipid metabolites in liver and intestine of themice.Resu ltsCompared with the wild type and heterozygousmice，the homozygous KO mice showed that no changes occurred in the appearance and body weight，there was only one band（247bp）appeared on the genotyping，the thickness in small intestinalmucosawas significantly increased with a lower expression level of alk-SMase，and the amountof sphingolipidmetabolites in the intestine and liver was changed，i.e.increase of SM and S1P，and reduction of ceramide.ConclusionsOur findings demonstrate that the homozygous KO mice have specific genotype and phenotype that do not affect their growth.Thesemice will provide an ideal animalmodel for further study of alk-SMase functions.

alk-SMase；Knockoutmouse；Genotype；Phenotype

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0495-05

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.010

2015-04-16

江蘇省創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才基金（項目號：蘇人才2013ˉ41）。

楊俐萍（1958ˉ04），女，博士，教授，主要從事腫瘤標志物研究，E-mail：liping.yang@ntu.edu.cn