盛佳鈺，陳紅風(fēng)

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院乳腺科，上海 200032）

研究報(bào)告

順鉑誘導(dǎo)三陰性乳腺癌4T1耐藥小鼠模型的建立

盛佳鈺，陳紅風(fēng)*

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院乳腺科，上海 200032）

目的建立一種耐藥性穩(wěn)定的三陰性乳腺癌4T1耐藥小鼠模型，為研究體內(nèi)腫瘤耐藥機(jī)制和逆轉(zhuǎn)藥物的篩選奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法采用順鉑（DDP）低劑量誘導(dǎo)及體內(nèi)外交叉致瘤結(jié)合的方法建立三陰性乳腺癌耐藥小鼠模型；MTT法檢測(cè)細(xì)胞耐藥特性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析耐藥相關(guān)基因MDR1、BCRP、MMP7及GST-π表達(dá)差異；免疫組化分析耐藥相關(guān)蛋白P-gp、BCRP、MMP7表達(dá)差異；蛋白印跡法檢測(cè)磷酸化Akt（phosphorate-Akt，p-Akt）和總Akt（total-Akt，t-Akt）蛋白表達(dá)；小動(dòng)物成像檢測(cè)觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果MTT顯示建立的三陰性乳腺癌耐藥4T1小鼠模型的耐藥指數(shù)為12.84；耐藥小鼠腫瘤組織中MDR1、BCRP、MMP7、GST-π基因mRNA的表達(dá)量及P-gp、BCRP、MMP7蛋白的表達(dá)量均高于非耐藥小鼠（P＜0.01）；Western blot顯示，耐藥小鼠腫瘤組織的p-Akt蛋白表達(dá)明顯高于非耐藥小鼠，t-Akt蛋白表達(dá)沒(méi)有差異。非耐藥小鼠與耐藥小鼠腫瘤組織生長(zhǎng)速度未見(jiàn)明顯區(qū)別（P＞0.05）。分別給予這兩種模型小鼠相同劑量的DDP治療后，耐藥小鼠對(duì)DDP的敏感性明顯低于非耐藥小鼠（P＜0.01）。結(jié)論初步建立了三陰性乳腺癌耐藥4T1小鼠模型，為三陰性乳腺癌臨床個(gè)體化治療及耐藥逆轉(zhuǎn)研究等提供了良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)。

三陰性乳腺癌；腫瘤抗藥性；順鉑；動(dòng)物模型；小鼠

目前認(rèn)為乳腺癌是一種高度異質(zhì)性腫瘤，不同的病理特點(diǎn)和分子特征導(dǎo)致其對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后明顯不同。臨床上根據(jù)免疫組化檢測(cè)的雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）表達(dá)均陰性者被稱為三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）。該亞型乳腺癌對(duì)內(nèi)分泌治療及抗HER-2的靶向治療均不敏感，因此化療是其主要的治療手段。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TNBC這類與乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene-1，BRCA1）相關(guān)的乳腺癌亞型對(duì)鉑類藥物表現(xiàn)出較高的敏感性［1］。然而，事實(shí)證明對(duì)化療相對(duì)敏感的TNBC患者并不意味著擁有更高的生存率。與其他化療藥物一樣，在臨床應(yīng)用過(guò)程中多數(shù)患者經(jīng)鉑類藥物化療緩解后，即會(huì)產(chǎn)生耐藥性而使后續(xù)治療效果受到嚴(yán)重影響。本實(shí)驗(yàn)以順鉑（cisplatin，DDP）為誘導(dǎo)藥物，三陰性乳腺癌細(xì)胞株4T1為誘導(dǎo)對(duì)象，采用化療藥物誘導(dǎo)耐藥及體內(nèi)外交叉致瘤的方式建立三陰性乳腺癌耐藥小鼠模型，并對(duì)三陰性乳腺癌4T1耐藥小鼠模型產(chǎn)生順鉑耐藥性的機(jī)制進(jìn)行初步探討，為耐藥逆轉(zhuǎn)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

注射用順鉑（凍干粉）購(gòu)自齊魯制藥有限公司（批號(hào)：ZWA2A1305034A），RPMI-1640液體培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）均為Gibco公司產(chǎn)品；四甲基氮唑藍(lán)（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）及DMSO均購(gòu)自上海生工生物有限公司。TRIZOL提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成；抗磷酸化 Akt（phosphorate-Akt，p-Akt）、總 Akt（total-Akt，t-Akt）、內(nèi)參GAPDH（均為抗兔單克隆抗體）及其相應(yīng)的二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；P-gp、BCRP、MMP7抗體均購(gòu)自美國(guó)ABCAM公司；EliVision plus試劑盒、DAB試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物科技有限公司，D-luciferin購(gòu)自上海樂(lè)辰生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物飼養(yǎng)

鼠三陰性乳腺癌細(xì)胞株4T1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入100 U/L青霉素和10 mg/mL鏈霉素。置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞貼壁情況并換液。貼壁生長(zhǎng)良好的乳腺癌細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠56只，體重16～18 g，其中24只小鼠用于耐藥動(dòng)物模型的建立（每輪6只，共4輪），余32只小鼠用于后續(xù)分組研究。小鼠均來(lái)源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）2012-0002］，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)在恒溫（23±2）℃，濕度50%～60%，人工光照明暗各12 h的飼養(yǎng)室內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來(lái)水自行取用。

1.3 模型的建立

采用化療藥物誘導(dǎo)耐藥及體內(nèi)外交叉致瘤的方式建立三陰性乳腺癌耐藥小鼠模型。將4T1細(xì)胞體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后按105個(gè)/只，接種于6只小鼠的第二乳房墊處，隨機(jī)均分為2組。待腫瘤組織長(zhǎng)至0.5 cm×0.5 cm時(shí)（約5 d），模型組（3只）荷瘤小鼠給予腹腔注射0.3 mg/mL DDP，對(duì)照組（3只）小鼠給予同等劑量的NS腹腔注射。每周1次，連續(xù)4周，給藥結(jié)束后，在無(wú)菌條件下取出各組腫瘤組織，行原代細(xì)胞培養(yǎng)。將組織塊置于培養(yǎng)皿內(nèi)，剪碎成米粒樣大小，用胰酶反復(fù)消化瘤塊，將消化下來(lái)的腫瘤細(xì)胞，按4T1細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。各組原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)穩(wěn)定傳代2次后，再接種于小鼠第二乳房墊，每次原代培養(yǎng)細(xì)胞均用采用MTT的方法計(jì)算耐藥倍數(shù)。反復(fù)4輪體內(nèi)外交叉致瘤，至耐藥倍數(shù)達(dá)到中度耐藥時(shí)（耐藥倍數(shù)5～15倍）為止。最后一輪小鼠給藥結(jié)束后，2組小鼠各取部分腫瘤組織置于4%多聚甲醛溶液及ˉ80℃冰箱保存用于免疫組化、real-time PCR及western blot檢測(cè)；剩余腫瘤組織分別行原代細(xì)胞培養(yǎng)。

取上述第4輪達(dá)中度耐藥的原代培養(yǎng)4T1/ DDP細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine TM 2000試劑操作指南進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48 h后，G418篩選抗性細(xì)胞及其單克隆化，得到穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的4T1/DDP-luc細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1/DDP-luc細(xì)胞接種到96孔黑板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。第2天采用活體成像儀進(jìn)行l(wèi)uc發(fā)光信號(hào)的觀察，檢測(cè)luc的表達(dá)，用Living Imaging軟件分析處理數(shù)據(jù)。

取32只小鼠，將上述經(jīng)鑒定能穩(wěn)定表達(dá)Luc質(zhì)粒的耐藥細(xì)胞株4T1/DDP-luc及非耐藥細(xì)胞株4T1-luc體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按105個(gè)/只，分別接種于4組小鼠的第二乳房墊處，分別建立三陰性乳腺癌耐藥及非耐藥小鼠模型各16只。待各小鼠腫瘤組織均長(zhǎng)至0.5 cm×0.5 cm時(shí)（約5 d），16只三陰性乳腺癌小鼠模型隨機(jī)分組為：Model-A組及DDP-A組，每組各8只小鼠；16只三陰性乳腺癌耐藥小鼠模型隨機(jī)分組為：Model-B組、DDP-B組，每組各8只小鼠。各組小鼠均按0.2 mL/20 g劑量腹腔注射相應(yīng)藥物，給藥頻次為，給藥周期為4周，具體給藥為：DDP-A及DDP-B組小鼠給予0.3 mg/mL DDP；模型組-A及模型組-B組小鼠給予0.9%生理鹽水。

1.4 M TT法檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期原代培養(yǎng)4T1細(xì)胞（Control組）和4批原代培養(yǎng)的4T1/DDP細(xì)胞（Model-1、2、3、4組），調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。置37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，加藥組更換為含不同濃度藥物的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每組都設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔（只含相應(yīng)培養(yǎng)液，無(wú)細(xì)胞）和對(duì)照孔（只含細(xì)胞、培養(yǎng)液）。待藥物組作用24 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）15μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)液和MTT溶液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩10 min使充分溶解顯色。用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（A490），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，按下式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

根據(jù)生長(zhǎng)抑制率，采用SPSS16.0軟件計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度（IC50），并按下式計(jì)算耐藥倍數(shù)（RF）。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)耐藥相關(guān)基因

采用TRIZOL法分別提取第4批耐藥模型Model-4組以及對(duì)照模型Control-4組小鼠腫瘤組織的總RNA，分光光度法測(cè)定其純度及濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將各組細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA，進(jìn)一步用MDR1、BCRP、MMP7、GST-π引物及內(nèi)參GAPDH引物擴(kuò)增（引物相關(guān)信息見(jiàn)表2）。Real-time PCR結(jié)果由Rotor-Gene 6軟件分析，確定各反應(yīng)樣本的Ct值，采用相對(duì)定量的2ˉΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析各樣本之間基因的表達(dá)差異。每組取三個(gè)樣本，取均數(shù)。

表1 引物合成表Tab.1 List of primers for the real-time PCR

1.6 免疫組化法檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白

取出第4批耐藥模型（Model-4組）及對(duì)照模型（Control-4組）小鼠腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋，5μm切片，常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3次，每次3 min；用pH 8.0 0.01 mol/L TE熱誘導(dǎo)修復(fù)（100℃，15 min），室溫自然冷卻，PBS洗3次，每次3 min；0.3%H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化酶10 min；室溫，PBS洗3次，每次3 min；20%正常羊血清室溫孵育30 min，不洗，適當(dāng)稀釋特異性一抗（P-gp、BCRP、MMP7抗體以1∶5000稀釋）37℃孵育2 h，PBS洗3次，每次3 min；EnVision試劑（HRP-M/R）37℃，30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色8～12 min；蘇木素襯染色，熱水藍(lán)化；吹干后，樹(shù)脂封片；鏡下觀察，核紫藍(lán)色，陽(yáng)性呈棕黃色。每組隨機(jī)選取5張切片，在200倍視野下，每張切片隨機(jī)選擇陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯的3個(gè)視野作為測(cè)定目標(biāo)。采用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，比較各組平均吸光度值。

1.7 W estern blot檢測(cè)Akt磷酸化相關(guān)蛋白

提取出第4批耐藥模型（Model-4組）及對(duì)照模型（Control-4組）小鼠腫瘤組織的蛋白，并定量樣本后，將等量的蛋白樣品（30μg）加入聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂牛奶的TBST封閉硝酸纖維素膜，室溫60 min，分別加入1∶8000稀釋的P-gp、MDR1及BCRP抗體及1∶5000稀釋的GAPDH（內(nèi)參照）抗體。置于4℃搖床過(guò)夜，用含0.05%Tween 20的PBS（PBST）洗3次，每次5 min，加入1∶8000稀釋的二抗室溫培育1 h，TBST洗滌3次，加入化學(xué)底物發(fā)光液結(jié)合顯影、定影和掃描。用Photoshop Image J軟件分析各條帶灰度值。以目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值的比值表示目的條帶的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 動(dòng)物活體成像檢測(cè)

取材處理前1 d，所有4組小鼠均行活體成像檢測(cè)。具體方法如下：實(shí)驗(yàn)前10 min將每組老鼠稱重，按0.2 mL/20 g體重的量腹腔注射D-luciferin試劑（PBS配比，最終使其濃度為15 mg/mL），用異氟烷將小鼠放人麻醉盒中麻醉，將小鼠安放于成像暗箱內(nèi)，調(diào)整體位為仰臥位，當(dāng)時(shí)間到達(dá)注射D-熒光素酶后的15 min，使用精諾真Xenogen IVIS成像向?qū)瓿蓤D像拍攝，應(yīng)用Living Image 4.3（Lumina XR）軟件對(duì)小鼠體內(nèi)區(qū)域信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。選擇反應(yīng)單位弧度、單位體積、單位時(shí)間從體內(nèi)發(fā)出的光子數(shù)的Radiance（photons）作為定量單位，即Radiance（p/s/cm2/sr），計(jì)算腫瘤灶數(shù)目。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。應(yīng)用SPSS 16.0軟件，兩兩比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

將在無(wú)菌條件下取出各組腫瘤組織行原代細(xì)胞培養(yǎng)，約24 h后幾乎所有的細(xì)胞都沉積于瓶底，輕晃培養(yǎng)瓶約2/3的細(xì)胞隨培養(yǎng)液晃動(dòng)，另1/3細(xì)胞貼壁。用PBS沖洗細(xì)胞后，顯微鏡下觀察可見(jiàn)，原代培養(yǎng)24 h后細(xì)胞呈三角形或多角形，并聚集生長(zhǎng)成團(tuán)塊；經(jīng)1次傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞分散程度較前改善，細(xì)胞形態(tài)趨于一致；經(jīng)2次傳代培養(yǎng)后，貼壁細(xì)胞增殖迅速，形態(tài)均一，以多角形為主，胞體飽滿（見(jiàn)圖1）。

圖1 4T1/DDP細(xì)胞形態(tài)變化（×200）Fig.1 Morphology of 4T1/DDP cells（×200）

2.2 耐藥程度測(cè)定

MTT法檢測(cè)原代培養(yǎng)的4T1細(xì)胞（Control組）以及4批原代培養(yǎng)的4T1/DDP細(xì)胞（Model-1、2、3、4組）對(duì)DDP的IC50分別為和5.73、9.50、17.16、36.03μg/mL及 73.63μg/mL，4批原代培養(yǎng)的4T1/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的RF分別為1.66、2.99、6.29及12.84，第4批原代培養(yǎng)的4T1/DDP細(xì)胞已達(dá)中等耐藥程度，可用以后續(xù)獲得性多藥耐藥小鼠模型建立（見(jiàn)圖2）。

2.3 鑒定4T1/DDP-luc細(xì)胞熒光素酶活性

將已獲得的穩(wěn)定表達(dá)luc熒光素酶的4T1/DDP細(xì)胞置于96孔黑板中，加入底物D-luciferin并輕輕混勻后，運(yùn)用活體成像系統(tǒng)對(duì)貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行成像和圖像釆集。圖3（左圖）顯示，4T1/DDP-luc細(xì)胞于96孔黑板中檢測(cè)到的生物發(fā)光信號(hào)。體內(nèi)檢測(cè)，將4T1/DDP-luc細(xì)胞接種于小鼠后1周，運(yùn)用活體成像系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行圖像采集。圖3（右圖）顯示，接種了4T1/DDP-luc細(xì)胞的小鼠檢測(cè)到的生物發(fā)光信號(hào)。

2.4 耐藥相關(guān)基因表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，第4批耐藥模型（Model-4組）腫瘤組織中MDR1、BCRP、MMP7及GST-π基因mRNA的表達(dá)量均高于control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），分別是control-4組腫瘤組織的2.05倍、3.85倍、3.58倍及3.66倍（見(jiàn)圖4）。

圖2 順鉑對(duì)4T1和4T1/DDP細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of DDP on proliferation of the 4T1 and 4T1/DDP cells

圖3 熒光素酶活性鑒定Fig.3 Identification of the luciferase activity

2.5 耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，P-gp、BCRP、MMP7蛋白在第4批耐藥模型（Model-4組）腫瘤組織中均較強(qiáng)（棕黃色顆粒為陽(yáng)性產(chǎn)物），分別為（4.34± 0.56）、（0.98±0.50）、（1.08±0.27）；而在Control-4組中表達(dá)均較低，分別為（14.93±1.18）、（10.95 ±1.62）、（15.66±1.11），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見(jiàn)圖5）。

2.6 Akt磷酸化相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)狀態(tài)下第4批耐藥模型（Model-4組）腫瘤組織內(nèi)磷酸化Akt（p-Akt）水平顯著高于control-4組，兩組t-Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。上述western blot研究結(jié)果證實(shí)了三陰性乳腺癌獲得性多藥耐藥小鼠模型順鉑誘導(dǎo)三陰性乳腺癌耐藥4T1小鼠模型中存在著PI3K/Akt通路改變（見(jiàn)圖6）。

2.7 腫瘤動(dòng)態(tài)觀察

第4周，通過(guò)活體成像系統(tǒng)對(duì)采集到的圖像進(jìn)行分析，以radiance（photons）為計(jì)量單位，計(jì)算各組小鼠體內(nèi)光子通量。如圖7，Mode-A組與Model-B組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與Model-A組相比，DDP-A組光子通量數(shù)減少（P＜0.01）；而與Model-B組相比，DDP-B組光子通量數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）?？梢?jiàn)，DDP對(duì)耐藥模型小鼠腫瘤的抑制效果明顯低于非耐藥模型小鼠。

注：**為與control-4組比較差異有顯著性（P＜0.01）。圖4 MDR1、BCRP、MMP7和GST-π的基因在control-4和model-4組腫瘤組織的表達(dá)Note.**P＜0.01 compared with the control-4 group.Fig.4 ThemRNA expression of MDR1，BCRP，MMP7 and GST-πin the tumor tissues of control-4 and model-4 groups

圖5 Control-4和model-4組腫瘤組織中P-gp、BCRP和MMP7的蛋白表達(dá)（×200）Fig.5 The protein expression of P-gp，BCRP and MMP7 in the tumor tissues of control-4 and model-4 groups（×200）

圖6 Control-4和Model-4組腫瘤組織中p-Akt、t-Akt的蛋白表達(dá)Fig.6 The protein expression of p-Aktand t-Akt in the tumor tissues of control-4 and model-4 groups

3 討論

順氯氨鉑（cisplatin，DDP），簡(jiǎn)稱順鉑，其抗瘤譜廣泛、活性高，且骨髓抑制等副作用較輕［2］。DDP的作用部位是DNA，它與DNA堿基產(chǎn)生鏈內(nèi)及鏈間交叉連結(jié)，阻止DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂［3］。三陰性乳腺癌存在一定的DNA損傷修復(fù)障礙，因此該類型乳腺癌對(duì)鉑類藥物敏感性較高。DDP物美價(jià)廉，治療效果好，但應(yīng)用中卻發(fā)現(xiàn)其容易產(chǎn)生耐藥性，部分患者先天和后天對(duì)鉑類藥物具有耐藥性［4］，嚴(yán)重降低該藥物的治療效果，使其抗腫瘤譜降低，限制了該藥物的臨床使用。

開(kāi)發(fā)耐藥腫瘤模型對(duì)于耐藥相關(guān)基礎(chǔ)研究和藥物評(píng)價(jià)意義重大。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)和逆轉(zhuǎn)劑的研究主要來(lái)自體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究成果，研究對(duì)象是體外誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞，并不能很好地反映體內(nèi)腫瘤耐藥形成的情況。腫瘤動(dòng)物模型水平的研究比腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)水平的研究更能模擬人體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)情況。目前常用的耐藥腫瘤的動(dòng)物模型建立方法有三種：轉(zhuǎn)基因法［5］、耐藥性腫瘤細(xì)胞懸液移植法［6］及藥物誘導(dǎo)法［7］。

注：**為與model-A組比較差異及其顯著（P＜0.01）。圖7 小鼠體內(nèi)光子通量數(shù)測(cè)定Note.**P＜0.01 compared with themodel-A group.Fig.7 Determination of the number of photons in vivo

但隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)藥物耐藥的形成機(jī)制眾多，主要包括外排蛋白的表達(dá)增加或活性提高、細(xì)胞解毒系統(tǒng)活力增強(qiáng)、抗腫瘤靶點(diǎn)改變以及凋亡應(yīng)答失敏等。這些因素并非獨(dú)立存在，往往相互關(guān)聯(lián)，共同介導(dǎo)了耐藥的發(fā)生［8，9］。因此，類似轉(zhuǎn)基因法這種借助單一因素建立的多藥耐藥腫瘤動(dòng)物模型難以模擬真實(shí)情況。而另兩種方法相比較，耐藥性腫瘤細(xì)胞懸液移植法簡(jiǎn)單易行，在已有耐藥細(xì)胞株的前提下實(shí)驗(yàn)周期短，應(yīng)用較廣；而藥物誘導(dǎo)法則相對(duì)周期較長(zhǎng)，但卻更能模擬臨床實(shí)際情況。目前，乳腺癌耐藥研究中應(yīng)用較多的是激素受體陽(yáng)性乳腺癌，針對(duì)三陰性乳腺癌的較少，且主要集中于阿霉素誘導(dǎo)耐藥，尚未有順鉑誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞模型。此外，由于耐藥細(xì)胞株構(gòu)建時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要9～12個(gè)月，因此，本研究采用了藥物誘導(dǎo)法建立三陰性乳腺癌耐藥4T1小鼠模型，并在傳統(tǒng)的化療藥物單純誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，增加了體內(nèi)外交叉致瘤的方法。將體外培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三陰性乳腺癌4T1細(xì)胞接種在小鼠第二乳房墊，形成腫瘤后，低劑量DDP體內(nèi)持續(xù)給藥4周誘導(dǎo)耐藥發(fā)生，采用腫瘤組織塊行體外原代培養(yǎng)細(xì)胞，再將此原代培養(yǎng)細(xì)胞分別于新一批小鼠第二乳房墊接種致瘤；反復(fù)4次。采用此種體內(nèi)外交叉進(jìn)行致瘤的方法，逐步提高耐藥性，不僅模擬臨床耐藥形成條件，還提高了耐藥細(xì)胞的致瘤率和縮短致瘤時(shí)間，并在誘導(dǎo)過(guò)程中做到了對(duì)耐藥性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，且整個(gè)建模時(shí)間縮短為4個(gè)月。

經(jīng)測(cè)定第4批原代培養(yǎng)4T1/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的RF為12.84，已達(dá)中等耐藥程度。通過(guò)real-time PCR及免疫組化鑒定該耐藥細(xì)胞的特性，MDR1、BCRP、MMP7及GST-π基因及P-gp、BCRP、MMP7蛋白均顯示其在三陰性乳腺癌4T1耐藥小鼠模型的腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在非耐藥小鼠模型的腫瘤組織中均呈現(xiàn)陰性表達(dá)。此外，通過(guò)western blot檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)此種方法建立的三陰性乳腺癌獲得性多藥耐藥小鼠模型中存在著Akt磷酸化的改變。通過(guò)小動(dòng)物活體成像儀對(duì)各組小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行直觀觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)4周生長(zhǎng)非耐藥小鼠與耐藥小鼠腫瘤組織大小未見(jiàn)明顯區(qū)別（P＞0.05）。而給予這兩種模型小鼠相同劑量的DDP治療后，耐藥小鼠對(duì)DDP的敏感性明顯低于非耐藥小鼠（P＜0.01），提示接種了4T1/DDP-luc細(xì)胞的模型小鼠體內(nèi)發(fā)生了耐藥。良好的耐藥模型的建立是進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，該耐藥動(dòng)物模型的建立，為三陰性乳腺癌臨床個(gè)體化治療及耐藥逆轉(zhuǎn)研究等提供了良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)。

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Fstablishment of a cisplatin-resistantmousemodel of 4T1 triple negative breast cancer

SHENG Jia-yu，CHEN Hong-feng*
（Department of Breast Surgery，Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200032，China）

【Abstract】ObjectiveTo establish a cisplatin-resistant4T1 mousemodel of triple negative breast cancer.M ethodsA drug resistantmice model was established with cisplatin（DDP）induction and in-vivo/in-vitro tumorigenic approach.Its resistance characteristics were identified by MTT assay.Changes of drug resistance gene（MDR1，BCRP，MMP7，GST-π）and protein（P-gp，BCRP，MMP7）expression，and phosphorate-Akt and total-Akt protein expression were evaluated by real-time PCR，immunohistochemistry and western blotmethod，respectively.Small animal live imaging technology was applied to detect tumor growth.ResultsResistance fold（RF）of cisplatin-resistant4T1 mousemodelwas 12.84.The expression of MDR1，BCRP，MMP 7，GST-πmRNA and P-gp，BCRP，MMP 7 proteins in the resistantmice were higher than that in the non-resistantmice.The result ofwestern blot showed that a statistically higher expression of p-Akt in resistantmice than that in non-resistantmice at protein levels（P＜0.01）.No significant difference of tumor growth rate was observed between non-resistant and resistantmice（P＞0.05）.Given same dose of DDP，resistantmice showed lower sensitivity than non-resistantmice significantly（P＜0.01）.ConclusionsWe have successfully established a cisplatin-resistant triple negative breast cancermodel inmice，which provides a new platform for further study on chemoresistant reversal strategy and individualized clinical treatment of this disease.
【Key words】Triple negative breast cancer；Neoplasm drug resistance；Cisplatin；Animalmodels；Mice

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0466-08

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.005

2015-04-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373647）。

盛佳鈺（1983ˉ），女，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治乳腺癌研究。E-mail：shengjiayu@gmail.com

陳紅風(fēng)。E-mail：chhfluk@126.com