黃健，程明軍，陳義松，丁景新，華克勤

（復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，上海 200011)

研究報(bào)告

IGF-1基因及電刺激治療對(duì)產(chǎn)后壓力性尿失禁大鼠模型的影響

黃健，程明軍，陳義松，丁景新，華克勤*

（復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，上海 200011)

目的研究IGF-1基因治療對(duì)產(chǎn)后壓力性尿失禁大鼠模型的影響，探索對(duì)該疾病理想的治療方法。方法 對(duì)240只SD雌鼠水囊陰道擴(kuò)張法建模，從185只成功模型中隨機(jī)選取148只并分為5組，分別進(jìn)行IGF-1基因治療、氨哮素藥物治療、電刺激治療、空質(zhì)粒載體注射和未治療，另選未建模大鼠20只作為空白對(duì)照，各組分別于治療后1、21、42和63 d進(jìn)行尿動(dòng)力學(xué)檢測、血清生化指標(biāo)（LDH，CK)檢測等，并在光鏡下觀察恥尾肌肌纖維的變化。結(jié)果在治療后21 d時(shí)，無論是最大膀胱容量、漏尿點(diǎn)壓力還是收縮力/肌重比，IGF-1組、電刺激組治療效果更佳；而IGF-1組與電刺激組兩組之間比較差異無顯著性（P＞0.05)。結(jié)論IGF-1基因治療和電刺激治療對(duì)產(chǎn)后壓力性尿失禁大鼠模型的效果優(yōu)于藥物治療等其他組。

IGF-1；基因治療；產(chǎn)后壓力性尿失禁；大鼠模型

壓力性尿失禁屬婦科常見病，表現(xiàn)為腹壓突然增加導(dǎo)致的尿液不自主漏出。產(chǎn)后壓力性尿失禁（postpartum stress urinary incontinence，PPSUI)是指繼發(fā)于妊娠和分娩后出現(xiàn)的壓力性尿失禁癥狀，發(fā)病率為10% ～60%[1-2］，在很大程度影響著產(chǎn)婦的生活質(zhì)量。近年來，隨著婦科泌尿?qū)W和盆底重建手術(shù)方式不斷普及，其術(shù)后并發(fā)癥也屢見不鮮，遠(yuǎn)期療效更是難以預(yù)估。因此SUI的非手術(shù)治療較前受到臨床更多的重視。

由于盆底肌肉和神經(jīng)損傷在其發(fā)病機(jī)制中占有主導(dǎo)地位，因此營養(yǎng)神經(jīng)肌肉和增強(qiáng)肌肉的收縮力可能預(yù)防和治療產(chǎn)后壓力性尿失禁的發(fā)生發(fā)展成為當(dāng)前的熱門課題。Kerns等[3］證明人重組胰島素樣生長因子（IGF-1)能夠提高神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端肌肉的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)；Bellini[4］認(rèn)為應(yīng)用腺病毒載體轉(zhuǎn)移人重組胰島素樣生長因子在治療神經(jīng)肌肉疾病有重大潛力。本研究在之前提高建模成功率的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上[5］，試圖從基因治療、電刺激治療、藥物治療的療效評(píng)估，來探索壓力性尿失禁理想的非手術(shù)治療方案。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制作和鑒定

1.1.1 動(dòng)物模型的制作

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:SPF級(jí)Sprague-Dawley雌性未產(chǎn)大鼠260只，鼠齡6個(gè)月，體重310～340 g，來源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK（滬)2012-0002］。無菌術(shù)在復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。按照隨機(jī)原則分為6組，240只大鼠建模，20只為正常對(duì)照。建模大鼠給予烏拉坦腹腔內(nèi)注射，仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)，將8Fr弗萊氏尿管插入大鼠陰道2～3 cm，氣囊中注入5 mL生理鹽水，給予平行陰道徑向的拉力300 g，8 h后取出水囊導(dǎo)尿管?？瞻讓?duì)照組不予處理。

1.1.2 動(dòng)物模型的鑒定

噴嚏實(shí)驗(yàn)和尿動(dòng)力學(xué)檢測大鼠的膀胱排空后將硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道插入膀胱，外側(cè)末端接動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)騽?dòng)力學(xué)檢測儀（AD Instruments-BIO Amp CF，QUAD Bridge)，采用Power LAB-Chart v5.2.1尿動(dòng)力學(xué)檢測軟件測定，通過微量泵以10 mL/h速度注入37℃含美藍(lán)的生理鹽水，當(dāng)尿道外口出現(xiàn)第一滴藍(lán)色尿液時(shí)，記錄具體時(shí)間以及膀胱內(nèi)壓力；通過微量泵注入速度乘以時(shí)間計(jì)算出最大膀胱容量，即刻的膀胱內(nèi)壓力為漏尿點(diǎn)壓力（leak point pressure，LPP)，反復(fù)測量三次取平均值。再次排空膀胱后注入最大膀胱容量一半的美藍(lán)生理鹽水。剪取一段鼠須，伸入大鼠鼻孔內(nèi)，致其出現(xiàn)噴嚏反射，當(dāng)有藍(lán)色液體從尿道外口溢出時(shí)為噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

對(duì)建模成功的大鼠隨機(jī)選取148只，128只平均每組32只分入4組:胰島素樣生長因子基因治療（IGF-1)組，物理（電刺激)治療組，氨哮素藥物治療組，未治療組。另設(shè)空質(zhì)粒注射組20只和未建模的空白對(duì)照組20只。

處理方法:第一組（IGF-1組):恥尾肌內(nèi)注射，每側(cè)注射0.1 mL（總量為每只1.5μg)；注射于尿道外口旁0.5 cm處，與表皮斜角45o進(jìn)針，深度為0.5 cm。IGF-1質(zhì)粒來源于吉滿生物科技（上海)有限公司。第二組（物理治療組):將電極插入雌性大鼠陰道后壁進(jìn)行電刺激治療（參數(shù):刺激電壓1.5 V，頻率為1 Hz，波寬0.1 ms，串長2 s)，每周兩次，每次20 min，共3周。第三組（藥物治療組):飲水中加30μg/mL氨哮素治療，共3周。第四組（未治療組):不予處理。第五組（空質(zhì)粒對(duì)照組):方法同基因治療組，恥尾肌中注射同等量的空載體質(zhì)粒0.1 mL/只，共1次。第六組（空白對(duì)照組):未建模。

在模型建立后1、21、42和63 d分別隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)組8只、空載質(zhì)粒組和空白對(duì)照組各5只進(jìn)行檢測。

1.3 血清生化檢測

采用眼球取血法取得大鼠眼底血液，經(jīng)離心獲取血清約0.5 mL，使用全自動(dòng)生化分析儀采用JSCC標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)應(yīng)法測定血清乳酸脫氫酶（LDH)、肌酸激酶（CK)。

1.4 盆底肌纖維光鏡下觀察

犧牲大鼠后取各組大鼠盆底兩側(cè)恥尾肌并做成病理切片，經(jīng)伊紅-蘇木素染色法（HE)染色，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，鏡下觀察盆底恥尾肌纖維的損傷情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，結(jié)果以MEAN±SD表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠模型的鑒定

200只SD大鼠按8 h水囊牽引法建立PPUI大鼠模型后，噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性和尿動(dòng)力學(xué)檢測均為異常185只，成功率為77.1% （185/240)，對(duì)照組為0（0/20)。鑒定完成后按前述的方法分組。

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照相比，治療后1 d時(shí)其他各組尿動(dòng)力學(xué)檢測，最大膀胱容量和漏尿點(diǎn)壓力均下降（P＜0.05)，隨后逐漸恢復(fù)（見圖1、2)。其中，21 d時(shí)IGF-1組、電刺激組與藥物治療組、未治療組、空載質(zhì)粒組、空白對(duì)照組比較恢復(fù)更好，且與空白對(duì)照組差異無顯著性（P＜0.05)，說明治療效果更佳；而IGF-1組與電刺激組兩組之間比較，差異無顯著性（P＞0.05)。

圖1 最大膀胱容量的變化Fig.1 Changes of maximum cystometric capacity in the rats.

圖2 漏尿點(diǎn)壓力的變化Fig.2 Changes of Valsalva leak point pressure in the rats at different time points

2.2 血清生化檢測

從圖3和圖4中我們可以發(fā)現(xiàn)，治療后1 d時(shí)其他各組的大鼠的LDH、CK含量與空白對(duì)照組相比差異有顯著性（P＜0.05)，21 d時(shí)IGF-1基因治療和電刺激治療組均與空白對(duì)照組差異無顯著性，隨后其他組逐漸恢復(fù)（見圖3、4)。

圖3 乳酸脫氫酶（LDH)Fig.3 Changes of lactate dehydrogenase in the rats at different time points

圖4 肌酸激酶（CK)Fig.4 Changes of creatine kinase in the rats at different time points.

2.3 盆底肌纖維光鏡下觀察

大鼠恥尾肌光鏡下觀察，IGF-1組肌肉纖維的損傷情況如下（見圖5):治療1 d時(shí)，肌肉嚴(yán)重?fù)p傷，肌細(xì)胞排列紊亂，變細(xì)，呈灶性分布；21 d時(shí)肌肉損傷略有恢復(fù)，肌細(xì)胞排列仍紊亂明顯；42 d肌肉損傷恢復(fù)較好，肌細(xì)胞較少紊亂；63 d時(shí)，肌肉損傷基本恢復(fù)或接近正常。

圖5 基因治療組盆底肌肉纖維H&E染色（×400)Fig.5 Histology of the pelvic floormuscle fibers in the gene therapy group at different time points.H&E staining.

3 討論

目前壓力性尿失禁非手術(shù)治療較前已有一定進(jìn)展，主要包括:盆底肌肉訓(xùn)練（凱格爾訓(xùn)練)、生物反饋治療、電刺激治療、藥物治療、子宮托和針灸療法等。其中凱格爾訓(xùn)練（Kegel exercise)是治療SUI常用的非手術(shù)治療方法，但該方法需要長期鍛煉，如患者難以堅(jiān)持而造成治療效果不理想[6］。盆底電刺激治療和生物反饋聯(lián)合應(yīng)用能夠提高治療效果，但患者需要在一定時(shí)間內(nèi)多次往返醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用特定的儀器才能治療，依從性并不理想。藥物治療如氨哮素、雌激素替代療法等，由于長期藥物治療副作用較大造成難以在臨床推廣[7］。近期Carr等[8］、李愛斌等[9］學(xué)者提出尿道周圍局部注射自源性干細(xì)胞的方法來治療SUI，取得了一定的療效，但該方法技術(shù)要求高，程序繁瑣，臨床應(yīng)用難度較大；而局部注射藥物治療SUI的方法，已逐漸進(jìn)入臨床工作者的考慮范圍[10，11］。目前觀點(diǎn)認(rèn)為，盆底功能康復(fù)治療幾乎沒有禁忌癥，即便病情重的患者選擇手術(shù)治療后，仍可用康復(fù)鍛煉來鞏固療效，其癥狀改善率大于50%[6］。

IGF-l是由肝臟合成和分泌的胰島素家族的一種多肽，在細(xì)胞的分化、增殖和個(gè)體的生長發(fā)育、尤其是肌組織的生長和修復(fù)過程中具有重要的促進(jìn)作用[12］。作為刺激因子，可以促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂，抑制細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等生物活性。因此，IGF-l成為基因治療某些疾病的理想靶點(diǎn)[13］，我們設(shè)想將IGF-1基因注入盆底肌組織，用于治療產(chǎn)后壓力性尿失禁如盆底肌肉群組織損傷，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)以期具有更好的治療效果。

本研究采用人重組IGF-1質(zhì)粒局部注射的方法治療PPSUI，以電刺激治療和氨哮素藥物治療做對(duì)照，探討基因治療PPSUI的可行性。結(jié)果顯示:在建模后，最大膀胱容量、漏尿點(diǎn)壓力、收縮力/肌重比均下降，乳酸脫氫酶（LDH)、肌酸激酶（CK)均升高（P均＜0.05)，隨后逐漸恢復(fù)，與我們之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。在治療后21 d時(shí)，無論是最大膀胱容量、漏尿點(diǎn)壓力還是收縮力/肌重比，IGF-1組、電刺激組與藥物治療組、未治療組、空載質(zhì)粒組、空白對(duì)照組比較，恢復(fù)情況更好（P＜0.05)，說明了更佳的治療效果；血清LDH和CK在IGF-1基因治療和電刺激治療組于21 d后就與對(duì)照組差異無顯著性而區(qū)別于其他各組，顯示出接受這兩種治療的大鼠模型在血清肌損指標(biāo)方面有了明顯的較早改善，而IGF-1組與電刺激組兩組之間比較差異無顯著性 （P＞0.05)。由于本研究只是單純采用兩側(cè)恥尾肌單點(diǎn)注射方法，可能不利于藥物的擴(kuò)散和吸收，從而影響了基因治療的優(yōu)勢體現(xiàn)。

綜上所述，對(duì)于PPSUI重組人IGF-1基因治療和電刺激治療的效果相似，且優(yōu)于氨哮素藥物治療等其他組，本研究在進(jìn)一步證實(shí)電刺激治療的安全有效性外，也體現(xiàn)出IGF-1基因治療對(duì)產(chǎn)后壓力性尿失禁模型大鼠的初步效果，但能否用于臨床患者尚需要更深入的基礎(chǔ)和臨床研究。

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Effect of IGF-1 gene and electric stimulation therapj on the rat model of postpartum stress urinarj incontinence

HUANG Jian，CHENG Ming-jun，CHEN Yi-song，DING Jing-xin，HUA Ke-qin*
（Department of Gynecology，Affiliated Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University，Shanghai200021，China)

ObjectiveTo study the effect of IGF-1 gene therapy and electric stimulation therapy on the ratmodels of postpartum stress urinary incontinence，and explore the ideal treatment for this disease.M ethods240 SD female rats were used to establish the model of postpartum stress urinary incontinence by water sac vaginal dilation.148 model rats were random ly selected from 185 successfulmodels and divided into 5 groups:IGF-1 gene therapy，clenbuterol treatment，electric stimulation therapy，injection of empty vector plasmid，and untreated groups.Besides，20 non-modeled rats were used as blank control group.Urodynamic testwas performed，pelvic floor pubococcygeusmuscle/muscle weight ratio was calculated，and serum biochemical indices（LDH，CK)were detected，and themorphological changes of pubococcygeus muscle fibers were observed by lightm icroscopy at1，21，42 and 63 days after treatment.ResultsAt21 days after treatment，themaximum bladder capacity，leak point pressure，the contractile force/muscleweight ratio in the IGF-1 group and electric stimulation treatment group were significantly better（P＞0.05)，and the differences between the IGF-1 group and electric stimulation group were not significant（P＞0.05).ConclusionsThe effect of IGF-1 gene therapy and electric stimulation on the ratmodels of postpartum stress urinary incontinence is better than that in the drug therapy group and other groups.

IGF-1；Gene therapy；Postpartum stress urinary incontinence；Ratmodel；Electric stimulation

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0617-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.014

2015-05-28

上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目（編號(hào):20124Y054)；上海市科委西醫(yī)引導(dǎo)類項(xiàng)目（編號(hào):124119a5501)；上海市申康醫(yī)院管理集團(tuán)新興前沿項(xiàng)目（編號(hào):SHDC12013120)。

黃?。?978-)，男，主治醫(yī)師，博士生，主要從事婦科研究。Email:huangjian102@sina.com

華克勤（1962-)，女，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事婦產(chǎn)科研究。Email:huakeqin@126.com