王厚磊，盧偉，李德芳，丁磊，吳靖平

（復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院骨科，上海 201508)

研究報(bào)告

大鼠椎間盤(pán)髓核細(xì)胞體外凋亡模型的建立

王厚磊，盧偉，李德芳，丁磊，吳靖平*

（復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院骨科，上海 201508)

目的建立大鼠椎間盤(pán)髓核細(xì)胞體外凋亡模型。方法為了充分模擬退變椎間盤(pán)內(nèi)營(yíng)養(yǎng)缺乏的微環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)分別采用含1%，3%，5%，8%，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)椎間盤(pán)髓核細(xì)胞，篩選最佳促凋亡濃度，分別檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白Bax、bcl-2、caspase-3酶的表達(dá)、細(xì)胞增殖曲線及免疫熒光分析。結(jié)果流式細(xì)胞儀測(cè)得髓核細(xì)胞凋亡率隨著胎牛血清（FBS)濃度降低而升高，3%FBS為最有效誘導(dǎo)凋亡濃度；Western blot示Bax、caspase-3酶表達(dá)在3%FBS組明顯高于10%FBS組，同時(shí)bcl-2表達(dá)下降；CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示含3%FBS的培養(yǎng)基內(nèi)，隨著凋亡率的增長(zhǎng)，髓核細(xì)胞增殖的速率越來(lái)越慢；免疫熒光分析3%FBS組FAS表達(dá)量明顯比10%FBS組增高。結(jié)論3%FBS能誘導(dǎo)髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失，caspase家族參與并執(zhí)行了這一過(guò)程。

椎間盤(pán)退變；髓核細(xì)胞；凋亡；營(yíng)養(yǎng)奪獲；大鼠

椎間盤(pán)退變（intervertebral disc degeneration，IVDD)是椎間盤(pán)退變性疾病發(fā)生的前提條件和病理基礎(chǔ)，是中老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病。IVDD是引起中老年腰背痛的主要原因之一[1］。椎間盤(pán)退變的主要病理變化為髓核細(xì)胞變性、壞死，髓核細(xì)胞外基質(zhì)分泌減少，逐步引起椎間盤(pán)基質(zhì)蛋白多聚糖和水分的丟失，進(jìn)一步導(dǎo)致膠原構(gòu)成改變[2］。而有研究稱(chēng)髓核細(xì)胞所產(chǎn)生的II型膠原、蛋白多聚糖和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分對(duì)維持椎間盤(pán)的完整性具有重要作用[3，4］。髓核組織異常是引起椎間盤(pán)退變的主要因素，髓核組織過(guò)早出現(xiàn)纖維化，逐漸引起纖維環(huán)裂縫，從而加速椎間盤(pán)退變[5］。目前，椎間盤(pán)退變的確切發(fā)病機(jī)制及病理變化過(guò)程仍不明確[6］。構(gòu)建理想的體外椎間盤(pán)細(xì)胞退變模型對(duì)研究椎間盤(pán)退變的發(fā)生機(jī)制，減緩或逆轉(zhuǎn)其發(fā)病過(guò)程具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

DMEM高糖型培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó))；Hoechst 33258、二甲基亞砜DMSO（Sigma公司，美國(guó))；annexin V-FITC/PI雙染試劑盒（BD，美國(guó))；caspase-3、bcl-2、Bax抗體、二抗（CST公司，美國(guó))；蛋白上樣緩沖液、BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天公司，中國(guó))；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（Corning公司，美國(guó))；發(fā)光液（Millipore公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱超凈工作臺(tái)（上海力申科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本)；流式細(xì)胞儀（BD公司，德國(guó))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠10只，10周齡，雌雄各半，體重150～200 g，來(lái)源于上海市公共衛(wèi)生臨床中心【SCXK（滬)2010-0024】，無(wú)菌手術(shù)在上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK（滬)2010-0098】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

10周齡SD大鼠，雌雄各半，水合氯醛腹腔麻醉后頸椎脫臼法處死，常規(guī)消毒，無(wú)菌條件下取下整個(gè)腰椎，解剖顯微鏡下剝離椎間盤(pán)周?chē)钅ず图∪獠@露椎間盤(pán)，將脊柱標(biāo)本用預(yù)先準(zhǔn)備的無(wú)菌PBS液清洗2次，用尖刀片輕輕刮除椎間盤(pán)上層軟骨終板，顯露軟骨終板之間的膠凍樣組織，細(xì)針輕輕挑出并放入盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剪碎為0.5 mm3左右組織塊，1000 r/min，5 min離心，離心后用PBS液沖洗3次，采用序貫消化法獲取髓核細(xì)胞，以約2×104的密度接種于培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于含5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行換液、傳代、鋪板，隨機(jī)進(jìn)入各實(shí)驗(yàn)分組。

1.2.2 建立低胎牛血清椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡模型

按照本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)方法建立髓核細(xì)胞凋亡模型。傳代細(xì)胞隨機(jī)進(jìn)入各實(shí)驗(yàn)分組，分為5組:1%胎牛血清（FBS)組、3%FBS組、5%FBS組、8%FBS組、10%FBS組，檢測(cè)各組的凋亡率，再進(jìn)一步行分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)軟骨終板細(xì)胞凋亡

采用annexin V-FITC聯(lián)合PI法進(jìn)行檢測(cè)樣本。結(jié)果判斷:聯(lián)合應(yīng)用annexinV-FITC和PI對(duì)培養(yǎng)體系中的細(xì)胞進(jìn)行染色，annexinV（-)/PI（-)代表健康活細(xì)胞，annexin V（+)/PI（-)代表早期凋亡細(xì)胞，annexin V（+)/PI（+)代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。在不同濃度血清下培養(yǎng)48 h后，收集各孔培養(yǎng)基的上清液（其中包含漂浮細(xì)胞)，貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集，二者混合后進(jìn)行離心棄上清，孵育annexin V-FITC與PI染色劑，上機(jī)進(jìn)行凋亡率檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)中凋亡細(xì)胞包括早期和晚期凋亡細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)caspase-3、Bax、bcl-2表達(dá)

流式篩選凋亡率最高的組別作為實(shí)驗(yàn)組，完全培養(yǎng)基10%FBS組作為對(duì)照組，傳代培養(yǎng)48 h后，去除各孔培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS液清洗一次，洗凈PBS后每孔加入RIPA裂解液80μL冰上裂解30min，混勻，收集裂解液4℃下14 000 r/min離心20 min取上清液，并測(cè)定蛋白濃度，取50μg蛋白與上樣緩沖液混合煮沸8 min，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，4℃時(shí)孵育一抗caspase-3（1∶1000)、Bax（1∶5000)、bcl-2、（1∶2000)稀釋液，孵育二抗，曝光，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.5 細(xì)胞增殖的檢測(cè)

收集處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的髓核細(xì)胞，以4×103/孔接種于96孔板。每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，分別在第0、12、24、48 h檢測(cè)細(xì)胞活性。按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，每孔中加入10μL CCK-8試劑，混勻后于孵箱中孵育2 h，然后在酶標(biāo)儀中測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的光吸收值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)

細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗、4%多聚甲醛固定、0.2%Triton X-100對(duì)細(xì)胞透化處理、1%FBS濃度PBS封閉，一抗稀釋液室溫孵育1 h，二抗稀釋液避光孵育1 h，Hoechst33258染核，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，數(shù)據(jù)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s)表示，進(jìn)行成對(duì)樣本的獨(dú)立t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髓核細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示:1%FBS組凋亡率（10.62 ±1.33)%，3%FBS組平均凋亡率（35.84± 1.05)%，5%FBS組凋亡率（20.15±0.75)%，8% FBS組凋亡率為（10.99±1.63)%，10%FBS組凋亡率（1.05±0.96)%，與其四組比較，3%FBS組凋亡率明顯增高，差異有顯著性（P＜0.05)（圖1)。

2.2 凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)

以3%FBS組與10%FBS組分別作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，Westernblot對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)顯示，βactin作為內(nèi)參，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組促凋亡蛋白Bax、caspase-3表達(dá)均較高，而抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)降低。3%FBS組細(xì)胞凋亡，灰度差異有顯著性（P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)達(dá)到預(yù)期效果（圖2)。

2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示:與10%對(duì)照組細(xì)胞相比，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，3%FBS組細(xì)胞活性逐漸降低，說(shuō)明細(xì)胞在含3%FBS的培養(yǎng)基內(nèi)，隨著凋亡率的增長(zhǎng)，細(xì)胞活性越來(lái)越低（圖3)。

2.4 免疫熒光檢測(cè)

FAS在細(xì)胞內(nèi)分布的熒光染色:FAS在細(xì)胞中平均分布的定量分析顯示，3%FBS組顯色強(qiáng)度比10%FBS組的增強(qiáng)（圖4)。FAS是細(xì)胞表面重要的死亡受體，與其配體結(jié)合后活化并傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，表明3%FBS組可能通過(guò)死亡受體途徑凋亡。

3 討論

椎間盤(pán)退行性疾病是臨床上常見(jiàn)病之一，其發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明，被認(rèn)為是多因素共同作用而導(dǎo)致。目前仍未找到有效的治療途徑緩解椎間盤(pán)退變。因此，從細(xì)胞分子水平研究其機(jī)制，從而找到有效治療途徑成為研究的焦點(diǎn)之一。本課題組著重研究建立可靠模型模擬椎間盤(pán)退變時(shí)細(xì)胞分子學(xué)改變，探究其明確發(fā)病機(jī)制。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡率Fig.1 Apoptosis rates of the nucleus pulposus cells detected by flow cytometry

構(gòu)建椎間盤(pán)退變細(xì)胞模型的方法有很多，比較常見(jiàn)的有化學(xué)誘導(dǎo)法和物理誘導(dǎo)法。國(guó)外學(xué)者研究證實(shí)[7］過(guò)量的激光照射傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系，會(huì)引起DNA堿基突變，導(dǎo)致核酸遺傳物質(zhì)改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。國(guó)內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)[8］，隨著不同劑量梯度紫外線的照射，細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)會(huì)不斷增加；化學(xué)試劑誘導(dǎo)法是在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入特定化學(xué)試劑，常見(jiàn)的有硝普鈉（SNAP)[9］、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β)[10］、過(guò)氧化氫（H2O2)[11］、抗 FAS抗體[12］等，這些構(gòu)建椎間盤(pán)細(xì)胞凋亡模型都能用于研究椎間盤(pán)退變時(shí)的細(xì)胞分子學(xué)改變，但按照上述方法建模時(shí)，不僅對(duì)細(xì)胞本身造成了直接損傷，同時(shí)改變了細(xì)胞生存的微環(huán)境，不能充分模擬椎間盤(pán)內(nèi)部低營(yíng)養(yǎng)代謝狀態(tài)。本課題組先前已用此實(shí)驗(yàn)方法建模[13］，并取得良好效果。此方法不僅能夠充分模擬椎間盤(pán)退變時(shí)內(nèi)環(huán)境變化對(duì)細(xì)胞造成的影響，而且此方法重復(fù)性高，經(jīng)濟(jì)成本低。

圖2 各組的caspase-3、Bax、bcl-2表達(dá)變化Fig.2 Changes of the expression of caspase-3，Bax，bcl-2 in each group

圖3 髓核細(xì)胞增殖檢測(cè)Fig.3 Test of the nucleus pulposus cell proliferation

圖4 大鼠髓核細(xì)胞熒光染色圖（×10)Fig.4 Fluorescence staining of the rat nucleus pulposus cells（×10)

隨著實(shí)驗(yàn)研究的深入，目前已發(fā)現(xiàn)[14，15］，椎間盤(pán)退變是在多種復(fù)雜因素共同作用下，引起髓核細(xì)胞過(guò)度凋亡，使蛋白多聚糖、水分等合成不足，最終導(dǎo)致椎間盤(pán)退行性改變，并且退變椎間盤(pán)內(nèi)髓核細(xì)胞凋亡率是正常狀態(tài)的2～3倍。髓核細(xì)胞作為椎間盤(pán)的重要組成部分，主要維持椎間盤(pán)的正常結(jié)構(gòu)及功能，過(guò)度凋亡的髓核細(xì)胞會(huì)破壞椎間盤(pán)的穩(wěn)定，使其發(fā)生退變，可見(jiàn)髓核細(xì)胞凋亡是椎間盤(pán)退變的重要因素[16-18］。

近來(lái)，國(guó)外研究證實(shí)[19］營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的直接因素，也是導(dǎo)致IVDD的最重要因素。椎間盤(pán)作為體內(nèi)的無(wú)血管組織，其營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)途徑主要如下[20，21］:（1)終板途徑:椎體內(nèi)血管的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物均可經(jīng)軟骨終板滲透到椎間盤(pán)內(nèi)外，軟骨終板發(fā)揮中介作用，營(yíng)養(yǎng)髓核及內(nèi)層纖維環(huán)；（2)纖維環(huán)途徑:纖維環(huán)表面血管營(yíng)養(yǎng)其外側(cè)1/ 3。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)，髓核細(xì)胞的數(shù)量及活性受到顯著影響，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤(pán)的退變。通過(guò)模擬椎間盤(pán)內(nèi)營(yíng)養(yǎng)缺乏導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的內(nèi)環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了椎間盤(pán)退變髓核細(xì)胞的體外模型，能更好的模擬體內(nèi)椎間盤(pán)退變時(shí)髓核細(xì)胞所發(fā)生的分子學(xué)變化。以annexin V-FITC/PI雙染色檢測(cè)其凋亡率時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著胎牛血清濃度的降低，髓核細(xì)胞凋亡率逐漸增加，3%FBS組細(xì)胞凋亡率較其余四組明顯增高；Western blot發(fā)現(xiàn)3%FBS狀態(tài)下髓核細(xì)胞Bax、caspase-3明顯升高、而bcl-2明顯下降。Bax/bcl-2比值與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，Bax表達(dá)增高時(shí)，不僅可形成Bax/Bax同二聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且促進(jìn)caspase-3的活化，但 bcl-2能抑制細(xì)胞凋亡[22，23］。Caspase-3作為凋亡執(zhí)行性酶，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖，活化后的caspase-3不斷切割底物，逐步放大蛋白酶級(jí)聯(lián)切割過(guò)程，最終激活核酸酶裂解核小體間的DNA，形成凋亡小體，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24，25］。

隨著年齡的增長(zhǎng)，椎間盤(pán)外周微血管數(shù)量會(huì)逐漸減少，椎間盤(pán)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)逐漸減少而代謝廢物逐漸堆積，乳酸大量沉積導(dǎo)致pH值下降，椎間盤(pán)細(xì)胞活性受損，最終導(dǎo)致椎間盤(pán)細(xì)胞凋亡。因此，本課題組認(rèn)為3%FBS導(dǎo)致髓核細(xì)胞活性降低，細(xì)胞外基質(zhì)成分的含量及含水量等減少，導(dǎo)致椎間盤(pán)力學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性下降，從而引起椎間盤(pán)退變。

目前，對(duì)于椎間盤(pán)退變的研究主要集中于軟骨終板及纖維環(huán)，而體外髓核細(xì)胞凋亡模型的建立更是鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)介紹的建模采用3%FBS培養(yǎng)方法充分模擬體內(nèi)椎間盤(pán)營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下髓核細(xì)胞的改變，篩選3%FBS濃度既能滿足髓核細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝，也能獲得較好的凋亡率效果，本模型不但證實(shí)了髓核細(xì)胞凋亡的存在，而且還發(fā)現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下髓核細(xì)胞凋亡很可能是通過(guò)死亡受體途徑實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)采用3%FBS培養(yǎng)法處理髓核細(xì)胞成功建立體外髓核細(xì)胞凋亡模型，并初步探討髓核細(xì)胞的凋亡機(jī)制，為進(jìn)一步研究髓核細(xì)胞凋亡機(jī)制及干預(yù)措施提供了基礎(chǔ)。

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Establishment of an apoptosismodel of rat disc nucleus pulposus cells in vitro

WANG Hou-lei，LUWei，LIDe-fang，DING Lei，WU Jing-ping*
（Department of Orthopedics，Jinshan Hospital of Fudan University，Shanghai201508，China)

ObjectiveTo develop an apoptosismodel of nucleus pulposus cells in cell culture.M ethodsTo mimic the nutrient-deficientmicroenvironmentof degenerative intervertebral disc，nucleus pulposus cells derived from infant SD rat disc were cultured under serum limiting conditions.Nucleus pulposus cellswere cultured in culturemedium containing 1%，3%，5%，8%and 10%fetalbovine serum（FBS)respectively to select the optimum FBA concentration.Apoptosis was assessed by flow cytometry，Western blot，cell counting kit，and immunofluorescence technique.ResultsThe flow cytometry revealed that apoptosis rate of the nucleus pulposus cells increased with decreasing concentration of FBS，and 3% FBSused in the experimentalgroup was themosteffective concentration to induce apoptosis（P＜0.05).Western blotdemonstrated significantly higher expression of Bax and caspase-3 enzyme in the 3%FBS group than in the 10%FBS group，while bcl-2 activity decreased.The results of CCK-8 test indicated that the nucleus pulposus cells gotslower proliferation in themedium containing 3%FBS.Immunofluoresence analysis showed that FASexpression was significantly higher in the 3% FBS group than in the 10%FBS group.Conclusions3%FBS condition may induce apoptosis in the nucleus pulposus cells and compromise the cell function to induce intervertebral disc degeneration.The caspase family should be involved in the process.

Intervertebral disc degeneration；Nucleus pulposus cells；Apoptosis；Nutrition deprivation；Rat

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0607-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.012

2015-06-24

上海市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目（編號(hào):2012-341)。

王厚磊（1989-)，男，骨科碩士在讀、研究方向?yàn)樽甸g盤(pán)退變預(yù)防與治療，E-mail:13211270011@fudan.edu.cn

吳靖平，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樽甸g盤(pán)退變預(yù)防與治療，E-mail:drwujp@126.com