游穎，馬雨楠，曾林，孫兆增

（軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071)

研究報告

iRhom2及其突變基因重組慢病毒的包裝和穩(wěn)定表達細胞系的建立

游穎，馬雨楠，曾林*，孫兆增*

（軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071)

目的通過重組慢病毒感染，建立iRhom2及其突變基因的Vero細胞穩(wěn)定細胞表達系，用于iRhom2的功能研究。方法將iRhom2及其突變基因克隆到慢病毒載體Lenti-OE-Flag，構(gòu)建重組慢病毒載體Lenti-OE-iRhom2和Lenti-OE-iRhom2mut，將重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK-293T包裝細胞，獲得重組慢病毒。將重組病毒感染Vero細胞，利用puromycin進行加壓篩選，獲得二者的重組表達細胞系。結(jié)果構(gòu)建了iRhom2及其突變基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并獲得了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，并利用該病毒獲得了二者的穩(wěn)定表達細胞系。Western-blot實驗證實，二者能夠在Vero細胞內(nèi)穩(wěn)定表達。結(jié)論利用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，成功獲得了iRhom2及其突變系的Vero細胞穩(wěn)定表達株，為進一步研究iRhom2的生物學功能及其機制奠定了良好的基礎(chǔ)。

iRhom2；慢病毒載體；包裝細胞；穩(wěn)定表達

UNCV無毛突變系小鼠是軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心培育的一種自發(fā)突變動物模型[1，2］，遺傳學研究表明該突變是單基因的常染色體半顯性遺傳。UNCV的純合突變外觀表現(xiàn)為無毛表型，雜合突變表現(xiàn)為稀毛表型。與常見的裸鼠不同，該動物模型的免疫系統(tǒng)基本正常。因此，在化妝品、皮膚藥物和一些皮膚真菌的研究中具有特殊的應(yīng)用[3］。

在前期的研究中，將UNCV無毛突變系小鼠的突變基因定位到11號染色體，并通過基因組掃描方式定位了突變基因 iRhom2[4-6］（GeneID: 109602)。UNCV無毛突變系小鼠的iRhom2基因的N端309 bp的缺失，導致了無毛性狀的產(chǎn)生。文獻報道iRhom2可能通過TACE調(diào)節(jié)Notch1和Wnt信號通路，從而影響毛囊的分化[7，8］。課題組前期的工作也證實iRhom2能夠影響TACE基因的成熟[9］，但最近文獻報道 iRhom2的基因敲除小鼠，反而具有被毛[10］。根據(jù)這些結(jié)果推測，iRhom2基因的N端309 bp的缺失，可能使突變蛋白具有了新的功能。本實驗室已經(jīng)克隆出小鼠iRhom2基因[11］。故課題組擬構(gòu)建iRhom2基因及其突變基因的穩(wěn)定表達細胞系，為iRhom2突變基因功能的比較研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒載體Lenti-OE（圖1)購自北京普瑞金科技有限公司，iRhom2及其突變基因質(zhì)粒由本室保存。感受態(tài)購自北京博邁德生物科技有限公司。慢病毒包裝細胞293T，Vero細胞購自中國科學院上海細胞庫。限制性內(nèi)切酶Xba I、Bgl II購自NEB公司，T4 DNA連接酶購自 Takara公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Biomiga公司。

圖1 Lenti-OE載體示意圖Fig.1 The diagram of Lenti-OE vector

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)iRhom2及其突變基因的全長基因序列，結(jié)合Lenti-OE載體的讀框、多克隆位點，設(shè)計引物。Rhbdf2-F:GCTCTAGAGCCACCATGGCCTCAGCTGACAAGAATG；Rhbdf2-R:GCGCATAGATCTTTAGTGTAGCACCTGGTCTAG。

1.2.2 Rhbdf2慢病毒表達載體的構(gòu)建

用Xba I和Bgl II雙酶切iRhom2質(zhì)粒。1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收iRhom2的DNA片段（野生型約2500 bp，突變型約2300 bp)，將這些片段用T4 DNA連接酶連接到同樣用Xba I和Bgl II酶切的Lenti-OE質(zhì)粒，16℃過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，涂氨芐平板，挑克隆，搖菌。

1.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定

基于模糊綜合評價法的PPP項目績效評價體系研究——以廣西壯族自治區(qū)那考河流域治理項目為例梁素萍 李欽琳23-55

利用Xba I和Bgl II雙酶切及PCR的方法鑒定重組質(zhì)粒。PCR反應(yīng)條件為94℃變性2 min，50℃退火30 s，68℃延伸3 min 30 s，循環(huán)5次；然后98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸3.5 min，循環(huán)30次，最后68℃終止延伸10 min。

1.2.4 病毒包裝

包裝病毒前1 d，取7×105HEK-293T細胞種植于60 mm平皿。第2天，觀察細胞密度約為60%～70%時，使用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（Lenti-OE control或 Lenti-OE-iRhom2、Lenti-OE-iRhom2mut質(zhì)粒各1μg，加pMD2.0G和psPAX2質(zhì)粒各1μg)，第2天換用新鮮培養(yǎng)基2.5mL，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收獲細胞培養(yǎng)上清2 mL，分裝，-80℃保存。

1.2.5 病毒感染

感染前1 d，胰蛋白酶消化Vero細胞，接種于細胞培養(yǎng)板上，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。種植Vero細胞2×105于6孔板；過夜培養(yǎng)，細胞貼壁后移去舊培養(yǎng)基，換用含病毒培養(yǎng)基（1.5 mL培養(yǎng)基含polybrene 10μg/mL+病毒液200μL)，混勻，加至細胞，感染過夜，第2天，移去含病毒培養(yǎng)基，換新鮮培養(yǎng)基，待48～72 h后，puromycin加藥篩選。

1.2.6 穩(wěn)定細胞系的建立

用puromycin篩選（預先摸索puromycin有效濃度，一般選用2～3 d可以殺死全部細胞的濃度為最優(yōu)濃度，Vero細胞的puromycin有效濃度為3μg/mL)。細胞在6孔板內(nèi)長滿后，加藥篩選，傳代培養(yǎng)至10 cm平皿，繼續(xù)加入puromycin，待長滿后，傳為2個10 cm平皿，長滿后，凍存對照、wt、mut過表達的細胞各2支，留取部分細胞WB鑒定過表達效果。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒鑒定

利用 PCR的方法，鑒定 Lenti-OE-iRhom2和Lenti-OE-iRhom2mut重組質(zhì)粒，分別在特定區(qū)域出現(xiàn)條帶（wt約2500 bp，Mut約2300 bp)，見圖2。

圖2 菌液PCR鑒定陽性克隆結(jié)果Fig.2 Identification results of the bacterial liquid by PCR

2.2 重組慢病毒的包裝結(jié)果

將Lenti-OE-irhom2轉(zhuǎn)入293T包裝細胞以后，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)熒光強度達到80%左右，證實病毒包裝成功。結(jié)果如圖3所示。

2.3 病毒滴度測定時結(jié)果

病毒包裝后，取加病毒原液的細胞，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并數(shù)出最后兩個有熒光的熒光細胞克隆數(shù)。假設(shè)為X和Y，則滴度（cfu/mL)=（X+Y ×10)×1000/2/X孔的病毒液的含量（μL)。其結(jié)果兩種慢病毒Lenti-OE-Null、Lenti-OE-irhom2、Lenti-OE-irhom2mut的病毒滴度分別為4.8×106cfu/mL、1.3×106cfu/mL、1.3×106cfu/mL。見圖4。

2.4 病毒感染Vero細胞的觀察結(jié)果

病毒感染細胞經(jīng)藥物篩選后，在熒光顯微鏡下觀察到GFP的表達（見圖5)。

2.5 Flag-iRhom2蛋白表達的檢測

Western blot結(jié)果顯示，Lenti-OE-Flag-iRhom2編碼蛋白質(zhì)（大小約為49×103)在Vero細胞中有表達（圖6)。

3 討論

慢病毒載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，目前在基因治療中研究較多。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它的優(yōu)點在于能夠感染多種難感染的細胞，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。且慢病毒能夠?qū)⑼庠椿虿迦爰毎蚪M內(nèi)，實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達。與此同時，慢病毒安全性很高，不產(chǎn)生任何有效的細胞免疫應(yīng)答[12］。本實驗所采用的慢病毒載體Lenti-OE，在宿主細胞內(nèi)，能以病毒RNA為模板在自身反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以此cDNA為模板合成雙鏈DNA，經(jīng)環(huán)化后通過病毒整合酶作用整合在宿主細胞的染色體上并長期表達。

病毒包裝是一個病毒載體與包裝細胞間的相互作用過程。因此，293T包裝細胞的密度是一個重要的限制因素。充分利用培養(yǎng)基所構(gòu)成的立體空間，在一定范圍內(nèi)可以大量地增加細胞數(shù)量，這樣就提高了與外源DNA結(jié)合的機會，增加了進入細胞的質(zhì)粒數(shù)量，獲得更高的病毒滴度。重組慢病毒載體經(jīng)包裝細胞包裝后，能用于基因轉(zhuǎn)染的有效病毒滴度一般需達到 105～107cfu/mL[13］。在本實驗中，HEK-293T產(chǎn)生的重組慢病毒Lenti-OE-Null、Lenti-OE-irhom2、Lenti-OE-irhom2的滴度分別為 4.8× 106、1.3×106、1.3×106cfu/mL。提示我們重組的慢病毒載體經(jīng)NIH/3T 3細胞包裝，能夠獲得有效的病毒滴度和較高的轉(zhuǎn)效率，可用于后續(xù)iRhom2基因轉(zhuǎn)染實驗。Vero細胞是一種異倍體細胞，用途廣泛。Vero細胞系是連續(xù)的非正倍體細胞，連續(xù)細胞系可以經(jīng)過許多分裂周期而不衰老。在本研究中，采用的是病毒感染和加入puromycin的方法獲得能夠穩(wěn)定表達iRhom2的Vero細胞，相對于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，病毒感染效率更高，這種細胞系更利于獲得可靠的實驗結(jié)果。

實驗將 irhom2基因克隆至慢病毒表達載體Lenti-OE，包裝后篩選出一株感染性重組病毒產(chǎn)生細胞系，對其細胞及其上清感染的vero細胞基因組DNA進行irhom2基因PCR分析，flag標簽的蛋白檢測，結(jié)果表明外源基因已整合到轉(zhuǎn)染細胞DNA中，證實了重組病毒的活性及其轉(zhuǎn)導靶細胞的可行性，為進一步應(yīng)用irhom2基因、闡明irhom2分子的功能奠定了基礎(chǔ)。

圖3 重組慢病毒包裝結(jié)果Fig.3 The packaging results of the recombinant lentivirus

圖4 病毒滴度測定時圖Fig.4 Results of virus titration

圖5 病毒感染Vero細胞后的觀察結(jié)果Fig.5 Fluorescence images of the virus-infected Vero cells

圖6 目的蛋白表達的鑒定Fig.6 Identification of the target protein expression

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Packaging of the recombinant lentivirus of iRhom2 and its mutant and establishment of a stable iRhom2-expressing cell line

YOU Ying，MA Yu-nan，ZENG Lin*，SUN Zhao-zeng*
（Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China)

ObjectiveTo establish a stable transfection cell line of iRhom2 and itsmutant through recombinant lentivirus infection.M ethodsThe full-length gene of iRhom2 and itsmutantwere cloned into the lentivirus vector Lenti-OE-Flag，and got recombinant lentiviral vector of Lenti-OE-iRhom2 and Lenti-OE-iRhom2mut.The constructed recombinant lentivirus vectorswere transfected into HEK-293T packaging cells to obtain the recombinant virus.Vero cellswere infected with recombinant virus.The stable expressing cell lines were obtained by pressure screening with puromycin.ResultsThe recombinant lentivirus vectorswere constructed and the recombinant viruswas obtained.The stable expressing cell lines were obtained using virus infection and the protein expression was testified with Western blotting.ConclusionsStable iRhom2-expressing Vero cell line and itsmutant are achieved by recombinant lentivirus infection.It paves the way for future study on biological functions and mechanism of iRhom2.

iRhom2；Lentivirus vetor；Packaging cell；Vero cell line

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0597-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.010

2015-06-23

國家自然科學基金重點項目（31030058)；國家科技支撐計劃（2011BA115B03)。

游穎（1990-)，女，碩士研究生，研究方向:實驗動物學，E-mail:youying0723@163.com

曾林（1965-)，男，研究員，博士生導師，研究方向:實驗動物科學，E-mail:zenglin1965@126.com；孫兆增（1977-)，男，副研究員，碩士生導師，研究方向:實驗動物分子遺傳學，Email:laxszz@aliyun.com