晁天柱，李鵬翔，徐福意，李凱，周宇荀，肖君華

（東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620)

研究報(bào)告

構(gòu)建基于熒光多重cPCR的小鼠基因拷貝數(shù)檢測方法

晁天柱，李鵬翔，徐福意，李凱，周宇荀，肖君華*

（東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620)

目的建立基于競爭性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（competitive polymerase chain reaction，cPCR)小鼠基因拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs)的檢測方法，用于檢測野生小家鼠來源一號(hào)染色體替換系群體（population of specific chromosome 1 substitution strains，PCSSs)的CNVs。方法選取小鼠一號(hào)染色體上11個(gè)CNVs位點(diǎn)，及7、9和X染色體上各1個(gè)內(nèi)對照位點(diǎn)，分別構(gòu)建克隆質(zhì)粒為競爭性粒模板，應(yīng)用cPCR技術(shù)，建立熒光通用引物多重cPCR檢測方法。結(jié)果多重cPCR方案適用于小鼠一號(hào)染色體上11個(gè)CNV位點(diǎn)的拷貝數(shù)檢測，且能準(zhǔn)確檢測X染色體的拷貝數(shù)。結(jié)論實(shí)現(xiàn)小鼠快速、高通量的CNVs檢測，可準(zhǔn)確檢測小鼠1號(hào)染色體中11個(gè)CNV位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異。

拷貝數(shù)變異；競爭性模板；通用熒光引物；cPCR；小鼠

小鼠是多基因復(fù)雜性狀研究的重要模式動(dòng)物，但利用遺傳多樣性缺乏的近交系小鼠只鑒定出小部分基因[1-3］。以具有豐富遺傳多樣性野生小家鼠[4］為供體建立的PCSSs群體，是QTL精確定位、基因鑒定的新策略[5］，是近交系品系的有益補(bǔ)充。但迄今，野生小家鼠和PCSSs群體的CNVs遺傳多態(tài)性研究甚少?？截悢?shù)變異 （CNVs)是人[6］和小鼠[7］基因組中一種豐富、重要的的遺傳多態(tài)性[8-10］。廣泛研究發(fā)現(xiàn)，CNV不僅影響哺乳動(dòng)物表型差異[11］，同時(shí)與許多人類疾病相關(guān)[12，13］。在41個(gè)近交系小鼠中，已鑒定2096個(gè)CNVs，共發(fā)現(xiàn)53個(gè)與人類疾病相關(guān)的基因[14］。且通過解析CNVs多樣性，能揭示近交系小鼠種群歷史，基因功能，指導(dǎo)建立人類疾病模型，并理解CNV發(fā)生機(jī)制和其潛在的生物功能[14］。

以芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的CNV檢測方法，雖適用于CNVs的高通量檢測，但其費(fèi)用高，敏感性、操作性和重復(fù)性上存在較大問題[15］。簡單多重?zé)晒釶CR方法成功檢測FCGR3A和FCGR3B的拷貝數(shù)，卻需要與靶基因相似的內(nèi)源 DNA重復(fù)序列為內(nèi)對照[16］。結(jié)合外源競爭模板的cPCR技術(shù)，能夠精確定量DNA，檢測DNA拷貝數(shù)[17，18］。質(zhì)譜與cPCR技術(shù)相結(jié)合成功定量mRNA，具有極佳的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[19］。而單堿基延伸與cPCR結(jié)合的方法，適用于所有序列和基因及基因內(nèi)相似CNVs，甚至是微小缺失和重復(fù)的檢測，但操作繁瑣[15，20］。因此，廉價(jià)、簡單的cPCR技術(shù)是檢測PCSSs群體CNV多樣性的合適選擇。

本研究以“野生小家鼠來源一號(hào)染色體替換系”群體構(gòu)建過程中的N7代染色體工程小鼠為樣本，利用cPCR技術(shù)，根據(jù)aCGH檢測結(jié)果選擇11個(gè)CNVs位點(diǎn)，構(gòu)建克隆質(zhì)粒競爭模板及熒光多重cPCR檢測方案，以期實(shí)現(xiàn)野生小家鼠來源1號(hào)染色體上CNVs的高通量檢測。

1 材料與方法

8周齡SPF級C57BL6/J（B6)小鼠（雌、雄各10只)，體重18～26g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK（滬)2012-0002］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守1988年動(dòng)物管理?xiàng)l例。實(shí)驗(yàn)在東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK（滬) 2014-0022］。收集14個(gè)PCSSs品系構(gòu)建過程中的F1和N7代鼠尾組織，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取和酶切

DNA提取采用Axygen（愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)基因組DNA抽提試劑盒。以0.8%瓊脂糖凝膠電泳，全自動(dòng)紫外與可見光分析儀FR-200A（上海復(fù)日科技實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究所)和NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國)確定DNA質(zhì)量和濃度?；蚪MDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ（NEB)酶切。

1.3 引物設(shè)計(jì)

利用棋盤法設(shè)計(jì)通用熒光引物:上游 FAMTTCATCCGTTCGTCCTAC； 下 游: ACAGCGTCAATCTCGTTC。14個(gè)位點(diǎn)的DNA序列信息來源于NCBI。所有引物用Oligo6設(shè)計(jì)，并由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。圖1A示意引物設(shè)計(jì)原則，所有cPCR特異引物和質(zhì)粒構(gòu)建用特異引物的序列信息，分別見表1和表2。

圖1 檢測位點(diǎn)側(cè)翼引物和cPCR原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the primers and cPCR principle

1.4 制備競爭性模板

將嵌合體引物的 PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T Vector載體[寶生物工程（大連)有限公司］并轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌。質(zhì)粒抽提采用SanPrep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoR I [寶生物工程（大連)有限公司］酶切為線性DNA，以1%的瓊脂糖凝膠電泳和FR-200A確定質(zhì)量。采用Tiagen（天根生化科技有限公司)質(zhì)粒小提試劑盒純化酶切質(zhì)粒，使用NanoDrop 2000c確定酶切質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度。

表1 11個(gè)CNV位點(diǎn)和3個(gè)內(nèi)對照位點(diǎn)的cPCR特異引物Tab.1 The specific primers of 11 CNVs and 3 internal control loci for cPCR

表2 構(gòu)建競爭性質(zhì)粒模板的特異引物Tab.2 The primers for the constrution of cloned plasmid competitors

1.5 aCGH分析

周媽的遺像擺在矮柜上，前面還放著一個(gè)玻璃瓶，周澤贍（小）踮起腳尖正要把鮮花插在玻璃瓶里，手不小心擋了一下瓶子，瓶子啪的一聲，連同鮮花掉在了地上。

選用SurePrint G3 Bovine CGH Microarray（Agilent)芯片，對樣本進(jìn)行CNV檢測。用 Agilent Genomic Workbench軟件采集并分析數(shù)據(jù)。所有微陣列比較基因組雜交（Array-CGH)檢測反應(yīng)由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張峰課題組完成。

1.6 兩步法cPCR

特異引物PCR體系（20μL)包括10×PCR buffer（30 mmol/L Mg2+)2μL，dNTP mix（2.5 mmol/L)3μL，上下游引物0.05μm/L，BSA（10 mg/mL)0.28μL，競爭性質(zhì)粒模板，DNA模板10 ng/μL，Taq DNA Polymerase 0.5 unit。反應(yīng)條件: 95℃ 2 min；94℃ 30 s，57℃ 90 s，65℃ 60 s，28個(gè)循環(huán)；68℃ 2 min（圖1B-Step1)。

通用熒光引物PCR體系（5μL)包括10×PCR buffer（30 mmol/L Mg2+)0.5μL，dNTP mix（2.5 mmol/L)0.75μL，上下游引物 0.05μm/L，BSA（10 mg/mL)0.07μL，Taq DNA polymerase 0.5 unit。反應(yīng)條件:94℃ 30 s，57℃ 90 s，65℃ 60 s，5個(gè)循環(huán)；68℃ 20 min（圖1B-Step2)。

1.7 毛細(xì)管電泳

PCR產(chǎn)物1μL，加入8.6μL的Hi-Di和0.4 μL的DNA分子標(biāo)準(zhǔn)，振蕩混勻變性。通過ABI測序儀3730（Applied Biosystems)分析樣本。用GeneScan Analysis?3.0和 GeneMapper?ID software v3.2軟件分析數(shù)據(jù)（圖1C)。

1.8 CNV位點(diǎn)拷貝數(shù)

每個(gè)CNV位點(diǎn)的R值（樣本峰/質(zhì)粒峰)，通過內(nèi)對照（7號(hào)和19號(hào)染色體上的檢測位點(diǎn))和質(zhì)控樣本（B6)糾正，最終反映每個(gè)CNV位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異。例圖1C，C位點(diǎn)為內(nèi)對照，M為檢測位點(diǎn)，相對拷貝數(shù)[RR=（SC/NC)/（SM/NM)］，所有值均為3730電泳峰高。質(zhì)控樣本RR=1.0，檢測樣本RR=1.5。

2 結(jié)果

2.1 CNV位點(diǎn)驗(yàn)證

aCGH檢測結(jié)果表明，11個(gè)CNV位點(diǎn)全部存在于染色體工程小鼠中。例如，1qE2.1-1qE2.位點(diǎn)，在大新和三門峽 F1代中為重復(fù)（圖2A和 B)，1qH2.3-1qH4位點(diǎn)在大新樣本是缺失（圖2C)。cPCR結(jié)果顯示，重復(fù)為樣本峰高于質(zhì)粒峰（圖2D)，缺失為樣本峰低于質(zhì)粒峰（圖2E)。

2.2 多重cPCR檢測方案

11個(gè)CNV位點(diǎn)的通用熒光引物多重cPCR檢測方案結(jié)果表明，相對質(zhì)控樣本B6小鼠DNA在目標(biāo)區(qū)段位置cPCR產(chǎn)物樣本峰和質(zhì)粒峰高度比值，能檢測樣本拷貝數(shù)變異。例如圖3中1qE2.1-1qE2.3和1qH2.3-1qH4位點(diǎn)（N1和N2)RR為1，在大新F1樣本中RR分別為0.5和1.5（圖2)。

圖2 aCGH和cPCR結(jié)果Fig.2 The results of aCGH and cPCR assays

圖3 通用cPCR方案的分離膠電泳Fig.3 Electrophoretogram of POP-6 products of the versatile cPCR

2.3 N7代樣本檢測

13個(gè)品系的N7代樣本檢測結(jié)果顯示，有5個(gè)CNV位點(diǎn)在60%以上野生小家鼠中具有拷貝數(shù)差異，4個(gè) CNV位點(diǎn)具有拷貝數(shù)變異的比例小于46%，1個(gè)CNV位點(diǎn)和2個(gè)內(nèi)對照位點(diǎn)無拷貝數(shù)變異。在44個(gè)樣本的 cPCR檢測結(jié)果中，Chr.X: 103039160-103039780位點(diǎn)拷貝數(shù)差異能準(zhǔn)確反映樣本性別。

3 討論

模式動(dòng)物小鼠是研究遺傳致病因素CNV的重要資源。且在近交系小鼠中，已發(fā)現(xiàn)與精神病[21，22］、焦慮[23］等多種復(fù)雜疾病相關(guān)的 CNVs，促進(jìn)了小鼠基因組的CNV變異情況的研究。目前CNV檢測方法包括芯片技術(shù)、測序技術(shù)和PCR技術(shù)[24-26］。CGH和SNP芯片技術(shù)具有快速、高通量和自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，但CGH技術(shù)難以檢測平衡相互異位及倒位，aCGH技術(shù)的敏感性和操作性亟待提高，SNP芯片技術(shù)不適用于重復(fù)序列和復(fù)雜CNV區(qū)域?；跍y序技術(shù)的CNV檢測方法，其速度快、分辨率高、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，但費(fèi)用高昂。以PCR為基礎(chǔ)的CNV檢測方法中:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通量低，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性不高；多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)，靈敏度和特異性較高，重復(fù)性強(qiáng)，檢測不到平衡異位和倒位突變。針對染色體工程小鼠一號(hào)染色體上少量CNV位點(diǎn)的檢測，需要一簡便、準(zhǔn)確的技術(shù)方法。

本研究結(jié)果揭示，利用根據(jù)低TM值，二級結(jié)構(gòu)的自由能數(shù)值△G（單位kcal/mol)＞ -4等原則獲得的通用熒光引物，成功構(gòu)建的基于熒光通用引物多重cPCR方案，適用于染色體工程小鼠一號(hào)染色體11個(gè)CNVs的拷貝數(shù)檢測工作。染色體工程小鼠在2個(gè)位點(diǎn)Chr.19:27915739-27916361和Chr.7:99758205-99758827無拷貝數(shù)變異，是合適的內(nèi)對照位點(diǎn)。

相比于近交系C57BL/6J小鼠，N7代染色體工程小鼠的一號(hào)染色體在10個(gè)CNV位點(diǎn)具有拷貝數(shù)變異，如CNV位點(diǎn)Chr 1:141896999-141897619在13個(gè)品系中具有較大拷貝數(shù)差異（1-4個(gè)重復(fù))，CNV位點(diǎn)Chr 1:175354538-175355160在群體中無拷貝數(shù)變異。單一親本起源，導(dǎo)致染色體工程小鼠群體中CNV位點(diǎn)的突變類型一致。而因親本來源不同，致使Chr.1:173496351-173496972和Chr. 1:168146833-168147454位點(diǎn)分別在棗莊1品系N7代群體內(nèi)和三門峽的F1代與N7代樣本間存在拷貝數(shù)差異。三門峽F1代和N7代個(gè)體間其余10個(gè)CNV位點(diǎn)拷貝數(shù)一致無突變發(fā)生，說明一般性傳代并不會(huì)改變CNV拷貝數(shù)。

總之，利用競爭性質(zhì)粒模板結(jié)合通用熒光引物的多重cPCR方法是一種廉價(jià)、準(zhǔn)確的CNV檢測方案。能準(zhǔn)確檢測小家鼠一號(hào)染色體上11個(gè)CNV位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異，適用于少量小家鼠樣本的快速、高效的CNV檢測工作。

[1］ Mott R，F(xiàn)lint J.Prospects for complex trait ananlysis in the mouse[J］.Mamm Genome，2008，19（5):306-308.

[2］ Flint J，ValdarW，Shifman S，et al.Strategies formapping and cloning quantitative trait genes in rodents[J］.Nat Rev Genet，2005，6（4):271-286.

[3］ Churchill GA，Airey DC，Allayee H，et al.The collaborative cross，a community resource for the genetic analysis of complex traits[J］.Nat Genet，2004，36（11):1133-1137.

[4］ Laurie CC，Nicker son DA，Nachman MW，et al.Linkage disequilibrium in wild mice[J］.PLoSGenet，2007，3（8):e144.

[5］ Xiao J，Liang Y，Li K，etal.A novel strategy for genetic dissection of complex traits:the population of specific chromosome substitution strains from laboratory and wild mice[J］.Mamm Genome，2010，21（7-8):370-376.

[6］ Redon R，Ishikawa S，F(xiàn)ith KR，et al.Global variation in copy number in the human genome[J］.Nature，2006，444:444-454.

[7］ Egan C，Sridhar S，Wigler M，et al.Recurrent DNA copy number variation in the laboratorymouse[J］.NatGenet，2007，39: 1384-1389.

[8］ Jakobsson C，Ozaki H，Nakajima T，et al.Genotype，haplotype and copy number variation in worldwide human populations[J］. Nature，2008，451:998-1003.

[9］ She X，Cheng Z，Zollner S，et al.Mouse segment duplication and copy number variation[J］.Nat Genet，2008，40:909-941.

[10］ Watkins-Chow DE，Pavan WJ.Genomic copy number and expression variation within the C57BL/6J inbred mouse strains [J］.Genome Res，2008，18:60.

[11］ Freeman JL，Perry GH，F(xiàn)euk L，et al.Copy number variation: new insights in genome diversity[J］.Genome Res，2006，16: 949-961.

[12］ Gonzalez E，Kulkarni H，Bolivar H，et al.The influence of CCL3L1 gene-containing segment duplications on HIV-1/AIDS susceptibility[J］.Science，2005，307:1434-1440.

[13］ Aitman TJ，Dong R，Vyse TJ，etal.Copy number polymorphism in Fcgr3 predisposes to glomerulonephritis in rats and humans[J］.Nature，2006，439（7078):851-855.

[14］ Culter G，kassner PD.Copy number variation in the mouse genome:implications for themouse as amodel organizm for human disease[J］.Cytogenet Genome Res，2008，123:297-306.

[15］ Kim HK，Hwang HL，Park SY，et al.Simple and versatilemolecularmethod of copy-number measurement using cloned competitors[J］.PLoSONE，2013，8（7):e69414.

[16］ Hollox EJ，Detering JC，Dehnugara T，et al.An integrated approach for measuring copy number variation at the FCGR3（CD16)locus[J］.Hum Mutat，2009，30:477-483.

[17］ Sestini R，Orlando C，Zentilin L，et al.Measuring c-erbB-2 oncogene amplification in fresh and paraffin-embedded tumors by competitive polymerase chain reaction[J］.Clin Chem，1994，40:630-636.

[18］ Okuyama N，Hatano Y，Park Y，et al.Quantitation of c-erbB-2 gene amplification in breast cancer tissue by competitive PCR [J］.Tumour Biol，1999，20:153-161.

[19］ Ding C，Cantor CR.A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flightMS[J］.Proc Natl Acad SciU S A，2003，100:3059-3064.

[20］ Stofanko M，Han JC，Elsea SH，et al.Rapid and inexpensive screening of genomic copy number variationsusing a novelquantitative fluorescent PCRmethod[J］.Dis Markers，2013，35（6): 589-596.

[21］ Avrabos C，Sotnikov SV，Dine J，et al.Real-time imaging of amygdalar network dynamics in vitro reveals a neurophysiological link to behavior in a mouse model of extremes in trait anxiety [J］.JNeurosci，2013，33（41):16262-16267.

[22］ Brennd?rfer J，Altmann A，Widner-Andr?R，et al.Connecting anxiety and genomic copy number variation:a genome-wide analysis in CD-1 mice[J］.Plos ONE，2015，10（5):e0128465.

[23］ Gonik M，F(xiàn)rank E，KeBler MS，et al.The endocrine stress response is linked to one specific locuson chromosome3 in amouse model based on extremes in trait anxiety[J］.BMC genomics. 2012，13:579.

[24］ TakahashiN，Tsuyama N，Sasaki K，etal.Segmental copy-number variation observed in Japanese by array-CGH[J］.Ann Human Genet，2008，72:193-204.

[25］ Kamath BM，Thiel BD，Gai X，et al.SNP array mapping of chromosome 20p deletions:genotypes，phenotypes，and copy number variation[J］.Human Mutat，2008，30:371-378.

[26］ Goossens D，Moens LN，Nelis E，et al.Simultaneousmutation and copy number variation（CNV)detection by multiplex PCR-based GS-FLX sequencing[J］.Human Mutat，2009，30:472 -476.

Establishment of a universal fluorescentmultiplex cPCR method for detection of copj number variations in m ice

CHAO Tian-zhu，LIPeng-xiang，XU Fu-yi，LIKai，ZHOU Yu-xun，XIAO Jun-hua*
（Institute of Biological Sciences and Biotechnology，Donghua University，Shanghai201620，China)

ObjectiveTo establish a high throughput general multiple competitive polymerase chain reaction（cPCR)detectingmethod of copy number variations（CNVs)for the population of chromosome 1 substitution strains from wild mice.MethodThe selected 14 loci，including 11 CNVs on chromosome 1 and internal control loci on other three chromosmes（Chr 7，Chr19 and Chr X)，were detected based on the universal fluorescentprimermultiple competitive polymerase chain reaction.All specific cloned plasmidswere constructed as competitors.ResultsAltogether 11 CNVswere designed in one panel，and the copy of Chr X accurately reflects the gender.ConclusionsA rapid and high-throughput fluorescentmultiplex cPCR assay is established which can be used for detection of copy number variations on chromosome 1 in mice.

Copy number variations，CNVs；Competitive template；Universal fluorescence primers；cPCR；Mice

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0591-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.009

2015-06-19

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào):31371257)；上海市科委關(guān)鍵項(xiàng)目（編號(hào):12140900404)。

晁天柱（1982-)，男，博士研究生，研究方向:醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)，E-mail:chaotianzhu@126.com

肖君華（1968-)，男，教授，研究方向:醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)，E-mail:xiaojunhua@dhu.edu.cn