齊一俠，張超，崔世軍，羅濤，谷涌泉，李建新，張建，汪忠鎬

（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血管外科，首都醫(yī)科大學(xué)血管外科研究所，北京 100053)

研究報告

糖尿病后肢缺血大鼠模型的建立與評估

齊一俠，張超，崔世軍，羅濤，谷涌泉，李建新，張建，汪忠鎬*

（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血管外科，首都醫(yī)科大學(xué)血管外科研究所，北京 100053)

目的研究糖尿病肢體缺血模型的建立方法，為糖尿病下肢缺血和糖尿病足研究提供試驗方法。方法 取25只Wistar大鼠分為模型組、對照組及假手術(shù)組，模型組腹腔注射鏈脲佐菌素（60 mg/kg)誘發(fā)糖尿病，血糖達16.8 mmol/L模型成功。糖尿病造模成功后，手術(shù)結(jié)扎大鼠左側(cè)股動脈、剪斷周圍動脈分支，建立左后肢缺血模型。術(shù)后激光多普勒監(jiān)測動態(tài)監(jiān)測雙后肢血流，同時觀察血糖、體重及尿量變化。術(shù)后21 d取后肢腓腸肌行肌肉HE染色，取結(jié)扎處股動脈免疫熒光染色觀察血管平滑肌增殖情況，CD31免疫組織化學(xué)染色檢測后肢肌肉毛細血管密度。結(jié)果在治療后21 d時，無論是最大膀胱容量、漏尿點壓力還是收縮力/肌重比，IGF-1組、電刺激組治療效果更佳；而IGF-1組與電刺激組兩組之間比較差異無顯著性 （P＞0.05)。結(jié)論成功建立有效、簡便易行的糖尿病后肢缺血模型，可用于糖尿病肢體缺血及糖尿病足的藥物干預(yù)研究。

糖尿??；肢體缺血；大鼠模型

糖尿病是以慢性高血糖狀態(tài)為特征的代謝異常綜合征，隨著病情進展，血糖異常增高損傷了血管新生的能力，導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥冠狀動脈疾病（CAD)和外周動脈疾?。≒AD)發(fā)生率明顯升高。PAD是除外心、腦動脈外的四肢、軀干動脈多發(fā)狹窄、閉塞及動脈瘤擴張為特征的外周動脈缺血性病變，以雙下肢膝關(guān)節(jié)以下為多見。模擬糖尿病并發(fā)外周動脈疾病的動物模型，對糖尿病血管疾病研究至關(guān)重要，由此可幫助我們理解潛在的發(fā)病機制和研發(fā)新的治療方法。本實驗在目前常用的糖尿病大鼠模型的基礎(chǔ)上建立后肢缺血模型，以探索動物模型制備的最佳條件；監(jiān)測血流動態(tài)演變及觀察組織病理改變，并與單純肢體缺血模型比較，為后續(xù)的干預(yù)實驗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF級雄性8周齡 Wistar大鼠20只，200～250 g，北京維通利華動物技術(shù)有限公司提供[SCXK（京)2010-0002］，實驗在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動物實驗中心[SYXK（京)2010-0013］進行。

1.1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma)，CD31兔抗鼠多克隆抗體 （PECAM-1，sc-1506R，Santa Cruz)，a-SMA人抗鼠單克隆抗體（A5228，Sigma)，F(xiàn)ITC-/Rho交聯(lián)二抗（Jackson Immuno-Research Laboratories)，二步法免疫組化檢測試劑盒（PV-9001，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)；卓越IV型血糖儀（德國羅氏)，激光多普勒血流成像儀（瑞典百靈威)，小動物氣體麻醉機，4倍手術(shù)放大鏡，正置熒光顯微鏡 （80i，Nikon 80i)，NIS-Elements BR圖像處理軟件系統(tǒng)（Nikon)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠糖尿病模型建立與分組

采用隨機抽樣原則，抽取12只設(shè)為模型組，其8只設(shè)為對照組，5只為假手術(shù)組。造模前大鼠禁食，不禁水，確保大鼠禁食8 h。STZ溶于pH=4.5的的檸檬酸緩沖液中，配制成濃度為8 mg/mL的 STZ溶液，模型組大鼠按60 mg/kg腹腔單次注射，建立糖尿病模型大鼠12只，于注射后3、7 d測隨機血糖＞16.8 mmol/L水平為成模標準，不符予以剔除；對照組腹腔注射生理鹽水。檢測STZ注射前，注射后第1、3、7、14、21天大鼠稱重、測量非禁食血糖。

1.2.2 建立下肢缺血模型

腹腔注射STZ后3 d，模型組、對照組大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉。取左下肢腹股溝韌帶中點皮膚切口，分離脂肪及筋膜層，4倍手術(shù)放大鏡下暴露、分離股動脈及其分支，在分出旋髂淺動脈之前、分出隱動脈之前結(jié)扎股動脈并剪斷結(jié)扎股動脈，并結(jié)扎所有股動脈分支，術(shù)畢縫合皮膚，同時取5只同體重大鼠作為假手術(shù)組，僅切開股鞘，之后并縫合皮膚。分別在大鼠股動脈結(jié)扎術(shù)前、術(shù)后、術(shù)后第3、7、14、21天，在室溫26～28℃相對恒定下，恩氟烷氣體麻醉大鼠，采用激光多普勒血流成像儀激光探頭放于動物的足底，連續(xù)測量5 min；記錄雙側(cè)血流基礎(chǔ)值（PU值)，計算患側(cè)/健側(cè)比率。

1.2.3 病理學(xué)檢測

術(shù)后21 d，取大鼠左下肢腓腸肌及左側(cè)結(jié)扎段股動脈及右側(cè)股動脈，4%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)橫切5μm厚切片，行HE和免疫組織化學(xué)染色（1∶500稀釋)免疫組化染色，每張切片隨機取6個不同的高倍視野（×400)，NIS-Elements BR圖像處理軟件統(tǒng)計每個視野內(nèi) CD31陽性毛細血管數(shù)（個/ HPF)；行免疫熒光染色檢測血管平滑肌增殖情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行分析，各組計量資料以均數(shù)±標準差（±s)表示。組間比較采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗，檢驗顯著性取α=0.05，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病模型指標監(jiān)測結(jié)果

根據(jù)對照組與模型組24～48 h的尿量情況（圖1)，可直接觀測到模型組在腹腔注射STZ后，尿量較對照組明顯增多，而且糞便密度也較對照組明顯增多。由表1可見對照組體重量正常增長，在腹腔注射STZ后1 d體重出現(xiàn)輕微下降，隨之體重增長緩慢，第3～21天模型組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，由此可見模型組大鼠出現(xiàn)典型的“三高一低”糖尿病癥狀。同時我們也對大鼠血糖進行驗證（表1)，STZ腹腔注射后模型大鼠血糖升高，并維持在較高水平，血糖值＞16.8 mmol/L，并且可維持21 d，而對照組大鼠血糖始終保持在正常范圍，二者比較差異明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義，證實了糖尿病模型建立成功。

圖1 糖尿病大鼠模型尿量改變情況Fig.1 Changes of urinary volume in the STZ-induced diabetic rats

2.2 后肢缺血模型指標監(jiān)測結(jié)果

圖2A可見，激光多普勒測血流值測得模型組和對照組患肢血流在術(shù)后1d下降至最低，隨后血流值恢復(fù)，術(shù)后7～21 d患肢血流明顯增多。在股動脈結(jié)扎切除前，模型組和對照組患側(cè)/健側(cè)比趨近于1；術(shù)后，在模型組和對照組血流比值均減少，兩組并無明顯差別。而在術(shù)后第7、14、21天模型組血流比值較對照組明顯減弱，差異有顯著性，表明患側(cè)血流值恢復(fù)情況較對照組差；而假手術(shù)組術(shù)前術(shù)后各時間點血流比值差異無顯著性。通過21 d獲取大鼠患側(cè)后肢腓腸肌進行橫斷切片，CD31免疫組織化學(xué)染色統(tǒng)計毛細血管發(fā)現(xiàn)（圖2B)，對照組糖尿病組大鼠患側(cè)和健側(cè)的毛細血管較對照組、假手術(shù)組明顯減少。而通過計算患側(cè)/健側(cè)毛細血管數(shù)比值:對照組為 75.8%、模型組為 63.1%、假手術(shù)組為103.8%，表明糖尿病減弱大鼠毛細血管新生功能，下肢血流恢復(fù)受損。此外，我們對肌肉進行HE染色發(fā)現(xiàn)（圖3A):與假手術(shù)組比較，對照組、模型組肌肉組織體積縮小，肌纖維萎縮，肌纖維間隙變寬，均呈現(xiàn)缺血性變化。模型組手術(shù)側(cè)肌纖維萎縮較對照組明顯，并呈現(xiàn)肌束膜內(nèi)肌原纖維萎縮。

2.3 后肢股動脈組織病理改變

大鼠在術(shù)后21 d取其結(jié)扎處股動脈主干HE染色（圖3B)可見:與假手術(shù)組比較，對照組、模型組股動脈均出現(xiàn)不同程度的內(nèi)膜增厚，增厚的組織均為有核結(jié)構(gòu)，模型組增厚程度較對照組明顯嚴重。進而對該部分組織進行免疫熒光化學(xué)染色（圖3C)發(fā)現(xiàn)增殖內(nèi)膜均為a-SMA陽性的血管平滑肌細胞，并非沉積血小板及血栓結(jié)構(gòu)，模型組血管平滑肌增殖情況較對照組更加嚴重。由此說明血糖升高能夠促進血管平滑肌增殖。

表1 大鼠血糖、體重指標的比較Tab.1 Comparison of blood glucose and body weight between themodel and control groups

圖2 糖尿病大鼠缺血模型血流指標變化情況Fig.2 Changes of blood flow after operation in the STZ-induced diabetic ischemic rats.

圖3 糖尿病大鼠血管肌肉病理改變情況（A×100，B-C×400)Fig.3 Pathological changes of the diabetic ischemia ratmodels

3 討論

本研究經(jīng)過系統(tǒng)摸索，通過評估糖尿病大鼠血糖、體重、后肢血流及血管組織病理檢測新生毛細血管的基礎(chǔ)上，建立了糖尿病肢體缺血模型，為糖尿病血管病變相關(guān)研究提供了重要的實驗基礎(chǔ)。

在STZ已經(jīng)廣泛用于制作大鼠的糖尿病模型[1］，從大鼠腹腔注射STZ后的體重、尿量、便量可以觀察到大鼠明顯的“多飲、多食、多尿，生長緩慢”的典型糖尿病癥狀可作為糖尿病模型的初篩標準。血糖值可作為衡量造模成功與否的確定標準，而國內(nèi)外文獻對血糖值變化標準不一:國內(nèi)把空腹血糖＞7.8 mmol/L或隨機血糖＞16.67 mmol/L作為成模的標準[2］；國外則采用:隨機血糖＞200 mg/dL或空腹血糖＞150 mg/dL（血糖換算18 mg/dL=1 mmol/L)作為成模的標準[3］。本實驗采用非空腹血糖作為判斷糖尿病模型成功與否的標準的優(yōu)點在于時間控制靈活，可操作性強，影響因素少，更重要是可對后續(xù)肢體缺血手術(shù)避免不必要應(yīng)激，減少術(shù)中、術(shù)后死亡，連續(xù)測量2次隨機血糖可以較好的反應(yīng)血糖水平。

連續(xù)觀測隨機血糖，模型組和對照組差別明顯表明糖尿病模型穩(wěn)定，可以維持21 d以上，可以作為后續(xù)施加藥物治療及各種干預(yù)因素，建立糖尿病各種并發(fā)癥模型方法。而STZ注射后3 d大鼠出現(xiàn)體重減輕，尿便量明顯增多，而后期模型組體重增加緩慢，較模型組仍有統(tǒng)計學(xué)意義。

急性缺血是肢體缺血模型的主流，最早源于家兔的缺血模型[4］。其制作方法大體上以結(jié)扎并切除后肢的供血動脈主干或其分支為主[5］。而大鼠的股動脈除延續(xù)為腘動脈外，還分為旋髂淺動脈、肌支、腹壁淺動脈、膝最上動脈、隱動脈，分離結(jié)扎時須處理這些分支[6］。本實驗采用連續(xù)檢測下肢血流的方法，單純結(jié)扎股動脈，血流值改變不明顯，而去除其他分支血管后，可見血流值明顯下降，其原因可能與大鼠后肢供血動脈分支之間以及盆部與下肢動脈分支之間存在豐富的吻合有關(guān)[7］。而本實驗在手術(shù)中發(fā)現(xiàn):股動脈的各個分支中，腹壁淺動脈位置表淺易于處理，而旋髂淺動脈多分布在腹股溝韌帶內(nèi)側(cè)上方，處理時易忽略，而造成術(shù)后血流改變不明顯，術(shù)中應(yīng)注意予以確切結(jié)扎。而股動脈結(jié)扎后的缺血模型標準評價可以應(yīng)用激光多普勒測定血流值（PU值)評價，本實驗結(jié)果表明術(shù)后基礎(chǔ)血流值小于15，可以認為缺血模型建立成功。

然而持續(xù)肢體缺血的動物模型必須具備以下4個條件[8］:（1)出現(xiàn)一定程度的缺血；（2)缺血可以保持一段時間；（3)缺血可以通過實驗測得的數(shù)值所證實；（4)缺血的肢體和正常的肢體可以進行比較。本實驗還發(fā)現(xiàn)，在利用患側(cè)/健側(cè)血流比值消除環(huán)境、機體差異的基礎(chǔ)上，連續(xù)測量下肢血流顯示了正常大鼠在術(shù)后最初的1～3 d患肢血流改善不明顯，到術(shù)后7～14 d患肢血流明顯增多，血流有一個快速的增加，可能代表了對缺血狀態(tài)的反應(yīng)，顯示出患肢側(cè)支循環(huán)的再通和擴張。術(shù)后14～21 d患肢血流趨近平臺期。而糖尿病大鼠在第7、14、21天、血流值都顯著低于對照組，進一步的病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)HE染色:模型組的較對照組肌肉萎縮明顯，并出現(xiàn)肌束膜內(nèi)肌原纖維萎縮。免疫組織化學(xué)標記對照組大鼠在股動脈切除后21 d毛細血管密度明顯增加，表明糖尿病損傷了大鼠對肢體缺血的血管新生應(yīng)答。這與近年國外研究糖尿病肢體缺血文獻結(jié)果一致，這可能與1型糖尿病損傷了VEGF依賴的血管新生機制有關(guān)，導(dǎo)致側(cè)支建立恢復(fù)障礙[5，9］。同時通過免疫熒光染色驗證了血管狹窄的主要病理改變?yōu)檠芷交≡鲋场?/p>

除本研究類似的糖尿病肢體缺血建模方法外，也存在其他研究糖尿病缺血方法，Lau[10］采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病Wistar大鼠于足背部切除其全層皮膚造成糖尿病足潰瘍模型。Katsuya在轉(zhuǎn)基因糖尿病C57BLKS/Jdb/db小鼠的基礎(chǔ)上，大腿背側(cè)局部加壓造成潰瘍模型[11］，但二者均沒有阻斷下肢血運。而在肢體缺血的研究中，Masaki在C57BL/6小鼠的基礎(chǔ)上，結(jié)扎切斷股動脈、股靜脈同樣導(dǎo)致了非重癥肢體缺血，結(jié)扎切斷髂動脈、髂靜脈導(dǎo)致嚴重肢體缺血[12］。但此模型雖能完全模擬糖尿病肢體缺血的股動脈狹窄，但同時也造成了遠端的靜脈回流障礙，不符合糖尿病肢體缺血的靜脈表現(xiàn)。

綜上所述，本文所建立的糖尿病肢體缺血模型實驗結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，是一種有效、簡便、易行、廉價的糖尿病缺血模型制作方法，為利用此模型進行相關(guān)干預(yù)手段的研究提供良好的實驗基礎(chǔ)。

[1］ Wu KK，Huan Y.Streptozotocin-Induced Diabetic Models in Mice and Rats[M］.John Wiley&Sons，Inc.，2001.

[2］ 農(nóng)慧，盛慶壽，梁健，等.STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的研究[J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，27（1):4-5.

[3］ 高秀瑩，周迎生.2型糖尿病鼠類模型的研究進展[J］.中國實驗動物學(xué)報，2014，22（4):71-76.

[4］ Madeddu P，Emanueli C，Spillmann F，et al.Murinemodels of myocardial and limb ischemia:diagnostic end-points and relevance to clinical problems[J］.Vascul Pharmacol，2006，45（5):281-301.

[5］ Couffinhal T，Silver M，Zheng LP，et al.Mousemodel of angiogenesis[J］.Am JPathol，1998，152（6):1667-1679.

[6］ 王增濤，郝麗文，李桂石，等，主編.WISTAR大鼠解剖圖譜[M］.山東:山東科學(xué)技術(shù)出版社，2009.

[7］ 楊盛家，陳兵，羅濤，等.大鼠后肢急性缺血模型的構(gòu)建及評估[J］.中國普通外科雜志，2009，18（6):580-583.

[8］ Pu L Q，Jackson S，Lachapelle KJ，et al.A persistent hindlimb ischemiamodel in the rabbit[J］.J Invest Surg，1994，7（1):49 -60.

[9］ Biscetti F，Straface G，De Cristofaro R，et al.High-mobility group box-1 protein promotes angiogenesis after peripheral ischemia in diabetic mice through a VEGF-dependent mechanism [J］.Diabetes，2010，59（6):1496-1505.

[0］ Lau TW，Sahota DS，Lau CH，et al.An in vivo investigation on the wound-healing effect of twomedicinal herbs using an animal model with footulcer[J］.Eur Surg Res，2008，41（1):15-23.

[1］ Kawai K，Suzuki S，Tabata Y，etal.Accelerated wound healing through the incorporation of basic fibroblastgrowth factor-impregnated gelatin microspheres into artificial dermis using a pressureinduced decubitus ulcermodel in genetically diabeticmice[J］. Br JPlast Surg，2005，58（8):1115-1123.

[2］ Masaki I，Yonemitsu Y，Yamashita A，et al.Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia:acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but notof fibroblastgrowth factor-2[J］.Circ Res，2002，90（9):966-973.

Establishment and evaluation of a diabetic ratmodel of hindlimb ischemia

QIYi-xia，ZHANG Chao，CUIShi-jun，LUO Tao，GU Yong-quan，LI Jian-xin，ZHANG Jian，WANG Zhong-gao*
Department of Vascular Surgery，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing 100053，China

ObjectiveTo establish a diabetic ratmodel of hindlimb ischemia，and provide a testmethod for diabetic limb ischemia and diabetic foot study.MethodsTwenty-fiveWistar ratswere divided into three groups:themodel group and control group（n=10)，and sham operated group（n=5).The rats ofmodel group were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ，60 mg/kg)，with the blood glucose level over16.8mmol/L，while the rats of control group were injected with normal saline.All the rats had the left femoral artery and its branches ligated，and then Doppler scan blood flow analysiswas performed for the two hind limbs after operation at different time points.In themeantime，the changes of body weight and blood glucose were observed.The animals were sacrificed at 21days after operation.HE staining was used to observe the pathological changes ofgastrocnemius and femoral arteries.Capillary density and intima hyperplasia were examined using immunostaining for CD31 and a-SMA.ResultsBlood glucose of themodelgroup ratswas significantly increased as well as the quantity of urine and feces，and associated with weight loss，which were maintained for more than 21 days.The blood flow of control ratswasmarkedly decreased immediatly after operation，reached to the lowest point after surgery，and recovered from 7-14 days after operation.In contrast to the control group，the model group showed amarked reduction in blood flow in the ischemic hind limb.Pathological examination revealed remarkable vascular atrophy and a significantly reduced number of vessels per high power field in the gastrocnemiusmuscle ofmodel group rats with respect to the control group，and the femoral arteries ofmodel rats weremore narrowed than that of the control rats.ConclusionsIn this study，an effective，convenient diabetic ratmodel of hindlimb ischemia is successfully established which will facilitate the studies of drug intervention for diabetic limb ischemia and diabetic foot in the future.

Diabetesmellitus；Limb ischemia；Ratmodel

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0586-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.008

2015-07-12

國家自然科學(xué)基金項目（編號:81470587)。

齊一俠（1979-)，男，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事血管外科研究。Email:qiyixia@126.com

汪忠鎬（1937-)，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事血管外科研究。Email:huakeqin@126.com