江雨 周裕林

（廈門市婦幼保健院產前診斷中心，福建廈門 361003）

我國假肥大肌營養(yǎng)不良征防控的技術路徑與優(yōu)生策略選擇

江雨 周裕林*

（廈門市婦幼保健院產前診斷中心，福建廈門 361003）

l 背景介紹

假肥大型肌營養(yǎng)不良征（Duchenne and Becker muscular dystrophy，DMD／BMD）是全球最常見的X-連鎖隱性致死性基因疾病之一，男嬰發(fā)生率約為1／3500［1］。臨床上根據發(fā)病年齡及病程差異，將患者分為杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和貝氏肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD），兩者都是由于編碼抗肌萎縮蛋白（dystrophin）的DMD基因存在缺陷而致病的。該基因定位于性染色體Xp21.2區(qū)域，是人類目前已知的最大基因，長度約為2.4Mb，包含79個外顯子?；颊呋蛉毕莸闹饕愋桶ㄍ怙@子缺失、重復及基因微小突變。

自被定義以來的近一個半世紀，DMD至今仍無治愈方法，患者生存質量普遍不佳［2］。因此，針對疾病遺傳機制及防控手段的研究一直是這一領域研究的熱點。Konda及Tsubaki［3］于1973年首次報道了對DMD高危孕婦實施產前診斷。自此之后，伴隨臨床取材與診斷技術的不斷進步，包括胎兒性別鑒定、胎兒肌肉活檢術、臍帶血肌酸磷酸激酶檢測、熒光原位雜交［4］及各類分子診斷技術先后被用于DMD的產前診斷中。對具有家族史的高危孕婦實施遺傳咨詢及產前診斷，避免新生患兒出生成為現(xiàn)今全球DMD防控的基本策略。而隨著分子診斷技術的日趨成熟，基因檢測已成為當前DMD疾病診斷及產前診斷的重要手段。

先天缺陷的防治是世界衛(wèi)生組織考量一國或一地區(qū)社會發(fā)展水平的重要指標，目前全球不少發(fā)達國家及地區(qū)將控制先天性缺陷作為社會發(fā)展整體戰(zhàn)略規(guī)劃之一。但總體而言，世界各國及各地區(qū)在這一領域的發(fā)展水平極不均衡，尤其在發(fā)展中國家，受限于醫(yī)療資源短缺等因素，包括DMD在內的眾多先天缺陷防控形式不容樂觀。作為全球最大的發(fā)展中國家，由于在疾病宣傳、保健、教育、預防等方面長期滯后，中國在DMD患者的確診率、患者生存周期、家族成員接受遺傳優(yōu)生服務比率等諸多方面與發(fā)達國家和地區(qū)存在著較大差距。據估算，全國DMD患者累積數(shù)量至今已超過10萬，且每年新出生患兒多達數(shù)千。本文之目的在于試圖分析導致這一現(xiàn)狀的根源，同時結合作者所在醫(yī)院的臨床實踐經驗，嘗試提出適應我國國情的DMD分子診斷技術路徑及遺傳優(yōu)生策略，以期為我國DMD防控工作的推進提供借鑒。

2 國內DMD防控基礎薄弱因素

從20世紀70年代起，國內陸續(xù)有學者開始關注于DMD的相關研究，此后在一些大中城市的高等級綜合醫(yī)院或婦幼保健院開展了DMD臨床診斷或產前診斷服務。時至今日，雖歷經40余年的探索與發(fā)展，且取得了一些成效，但相較于龐大的患者人群，我國在DMD的遺傳咨詢及優(yōu)生服務供應能力上仍顯得十分薄弱?，F(xiàn)實中，患者往往需要輾轉數(shù)家醫(yī)院尋求確診。以作者單位所在的福建省為例，人口數(shù)量約4000萬的全省僅有兩家醫(yī)療機構具備DMD產前診斷能力。按照報道的發(fā)生率估算，該省每年新出生的DMD患兒數(shù)約在50例左右，患者總數(shù)應已累計達數(shù)千例。而實際上，作者所在醫(yī)院自2007年開展DMD臨床基因檢測以來，至今僅確診32個DMD病例家系（數(shù)據未發(fā)表）。因而有理由推斷，該省仍有為數(shù)眾多的患者可能由于各種原因而未能獲得及時準確的診斷。作為經濟社會發(fā)展相對發(fā)達的沿海省份尚且如此，全國面臨的總體現(xiàn)狀可見一斑。事實上，我國至今未出臺罕見疾病的官方定義，未制定任何正式的遺傳咨詢相關政策及指導性文件，相關政策法規(guī)的欠缺和不完善是導致我國在類似DMD等罕見疾病防控基礎薄弱的根本原因。而政策法規(guī)的不完善進而導致一系列與此相關的各環(huán)節(jié)進展緩慢。這其中，以下兩個問題顯得尤為突出：首先，人才儲備的不足已成為制約我國遺傳病防控的首要原因，目前國內大多數(shù)醫(yī)學院校未開設專門的醫(yī)學遺傳學專業(yè)，同時也無專門的機構進行遺傳咨詢師的認證與考核，致使全國至今幾無醫(yī)院設置專門的遺傳咨詢門診，絕大多數(shù)先天缺陷或遺傳病患者只能根據其臨床表征尋求對癥科室的診療，而由于并未受過系統(tǒng)的醫(yī)學遺傳學訓練，多數(shù)臨床醫(yī)師對此類疾病的癥狀及發(fā)病機制認識模糊，誤診、漏診現(xiàn)象十分常見［5，6］；其次，我國目前實施的醫(yī)學檢驗與產前診斷的的準入機制事實上也已成為罕見病防控的另一阻礙因素，21世紀以來，臨床分子診斷水平極速發(fā)展，包括DMD在內的不少先天疾病的臨床診斷技術已趨于成熟，然而因未能符合我國當前實施的臨床技術準入制度，以致大多數(shù)醫(yī)療機構，尤其是公立醫(yī)院，即便已然具備技術儲備，卻因顧及法律及政策風險而不愿貿然開展，拒診病患的現(xiàn)象時有發(fā)生。

依上可見，相關行政部門應盡快制訂先天缺陷、基因疾病的臨床應用服務規(guī)范，扭轉長期以來重治療、輕預防的固有思維模式，同時加大罕見病的宣傳、教育和投入，才能從根本上為患者及醫(yī)務人員提供保障。

3 DMD分子診斷技術選擇

除政策法律因素外，DMD遺傳異質性及診斷技術的多樣性，客觀上也對準備開展此類服務的醫(yī)療機構提出了較高的技術和管理要求。目前，臨床上常用的DMD的診斷方法包括血液生化檢測、肌電圖分析、肌肉活檢及分子診斷等。由于缺少權威的技術指導，國內部分已開展DMD臨床診斷服務的醫(yī)療機構往往根據自身條件選擇一類或幾類技術聯(lián)合檢測，并未形成統(tǒng)一的實施規(guī)范。其中，即便是如今已被普遍公認為疾病確診主要依據的分子診斷技術，各自的選擇也往往并不一致，客觀上造成了不同診斷機構在疾病確診率上的差異。目前常見的DMD分子診斷方法主要包括多重 PCR（multiplex- PCR，m PCR）、多重連接探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplification，ML PA），變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DH PLC）、Sanger測序及用以連鎖分析的短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）技術。診斷機構在選擇技術的過程中，需了解每一類技術在DMD診斷中存在各自的優(yōu)勢及缺陷，見表1。

3.1 多重 PCR 據統(tǒng)計，約50%～65%的DMD／BMD患者為DMD基因外顯子缺失所致，因而對此類基因型的排查往往成為臨床DMD分子診斷的優(yōu)先考量。由于無需復雜的大型儀器設備，且具備操作簡易、成本低的優(yōu)勢，多重 PCR成為國內部分開展DMD臨床分子診斷醫(yī)院的選擇［7-9］。相較于優(yōu)勢，該方法的缺點亦較突出，一是檢測范圍無法覆蓋DMD基因所有外顯子；二是無法檢出女性攜帶者。此外，凝膠電泳過程也較易導致 PCR產物的污染，并進而影響到后續(xù)診斷的可靠性。

3.2 連鎖分析 連鎖分析的原理是通過親代與先證者基因標記位點的多態(tài)性，建立突變基因與標記等位基因的連鎖相，從而對其他親屬或下一次妊娠胎兒的基因型進行判斷。DMD連鎖遺傳分析一般選擇DMD基因兩端及內含子區(qū)短串聯(lián)重復序列［10］。其主要優(yōu)點在于當無法通過其他技術獲得先證者基因型時，可通過連鎖相得到的基因單體型信息判斷后代的疾病再發(fā)風險。但需要注意的是，在某些情況下，使用該技術可能出現(xiàn)因多態(tài)信息量不足而無法分析的情況。此外，如果基因在減數(shù)分裂中發(fā)生了重組，或先證者為單純散發(fā)病例，若仍依據原先的連鎖相確定受檢者的基因型，就有誤診的可能性。因此在臨床實踐中，為提高診斷的可靠性，連鎖分析一般需與其他分子診斷技術聯(lián)合使用［11］。3.3 ML PA 該技術是2002年由Schouten等［12］開發(fā)的一種中通量基因拷貝數(shù)分析方法。作為目前唯一的商品化DMD基因檢測方案，該技術可在2個 PCR反應內實現(xiàn)對DMD基因所有外顯子的拷貝數(shù)信息分析。ML PA對由外顯子拷貝數(shù)異常導致的患者及攜帶者均具有較佳的檢測靈敏度。另外，對處于探針雜交或連接位點的微小基因突變，該技術也具有一定的檢出能力。隨著毛細管電泳設備的日益普及，ML PA事實上已成為當前全球DMD臨床診斷的首選方案［13，14］，在國內已開展DMD基因診斷的醫(yī)療機構中，亦多為采用。但需注意的是，對于因基因微小突變所致的病患，多數(shù)情況下ML- PA無法檢出。此外，對于經ML PA診斷為單外顯子缺失型病例，需通過其他方法進一步區(qū)分屬于外顯子部分序列的缺失，還是因探針雜交或連接位點的突變所致［15］。

表l DMD基因診斷技術比較

3.4 DH PLC 變性高效液相色譜是一類在單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SN P）研究中常見的分析技術。盡管同時具有基因拷貝數(shù)分析功能，但受限于檢出能力［16］，在DMD診斷中，該技術主要被用于基因微小突變篩查［17-19］。由于并非對核酸序列的直接測定，故經DH PLC檢測提示陽性結果者，需進一步經測序驗證。因此總體而言，盡管DH PLC的優(yōu)勢在于檢測成本相對較低，然而由于局限較多、穩(wěn)定性易受干擾，因而多用于學術研究而鮮見于臨床診斷。

3.5 Sanger測序 同DH PLC類似，Sanger測序在DMD遺傳分析中主要針對于基因的微小變異［20］。其相較于前者的優(yōu)勢在于，檢測發(fā)現(xiàn)的病理性突變可直接作為基因診斷的結論。其缺點是成本較高、實驗設計復雜，此外如果實驗設計的覆蓋范圍僅限外顯子區(qū)域，則由內含子突變導致的DMD無法檢出。

3.6 高通量測序（high-throughput sequencing，H TS） 由于DMD基因變異類型的多樣性，上述幾類技術在DMD的診斷中不同程度的存在檢出能力不足的問題。有鑒于此，臨床上亟需一種可覆蓋所有DMD突變類型的檢測技術，而隨著高通量測序技術的出現(xiàn)和成熟為這一問題的解決提供了可能。近年來，已有學者嘗試將高通量測序應用于DMD的疾病診斷［21-23］，并取得了良好的效果。缺點是現(xiàn)階段仍受技術準入及成本等制約，預計在國內的大規(guī)模臨床應用尚需時日。

4 DMD臨床咨詢、診斷及遺傳優(yōu)生策略

遺傳咨詢的主要目標有兩點，一是判斷疾病是否屬于遺傳，二是評估疾病在患者家系后代的再發(fā)風險。相較于我國南方較為常見的地中海貧血等遺傳疾病，除患者的基因變異類型存在多樣性外，人群中DMD的發(fā)生方式也具有異質性。患者基因突變可能源于親代伴性遺傳、親代生殖腺嵌合，或是單純散發(fā)。DMD突變類型及遺傳方式的這些特點對臨床遺傳咨詢及診斷策略的選擇提出了一定的挑戰(zhàn)。然而由于國內長期無相關臨床操作規(guī)范可供醫(yī)療機構實施借鑒，導致不少誤診、漏診的情況發(fā)生。有鑒于此，作者所在單位參照歐洲多個國家聯(lián)合發(fā)布的DMD產前診斷實踐指南［24］，同時結合自身臨床實踐經驗，提出如下操作建議。

4.1 知情同意原則 臨床實施DMD基因診斷的一個重要前提是須向就診者說明所采用技術的局限性。由于ML PA檢出范圍僅限于基因的大片段缺失、重復及少數(shù)微小突變，因此有部分患者或其親屬可能無法通過該技術發(fā)現(xiàn)致病基因變異，而對擬接受高通量測序等技術進一步排查者，亦需說明存在不能檢出致病突變的可能性。（圖1）

4.2 先證者／攜帶者基因檢測策略 綜合疾病檢出率及檢測成本等因素考量，具備條件的醫(yī)院機構現(xiàn)階段應考慮以ML PA為一線DMD基因篩查技術。需要注意的是，對于ML PA提示為單外子缺失的結果，需進一步驗證；對臨床高度懷疑為患者或攜帶者，如ML PA檢測為陰性，可建議其進一步行高通量測序檢測（圖1）。

圖l DMD基因診斷流程圖

4.3 DMD產前診斷策略 針對預行產前診斷者，應同時獲知先證者及其本人基因型，對于因先證者病逝等原因無法獲取樣本、并無法獲知先證者基因型信息的情況下，如受檢者為體細胞DMD攜帶者，則建議實施產前診斷；如在可供選擇的檢測范圍內未檢出體細胞攜帶致病突變，則應向其說明后代再發(fā)風險，尤其是針對曾經生育基因突變明確患兒的高風險女性，需告之存在生殖腺嵌合的可能，并由其本人知情選擇是否實施產前診斷（圖2）。

5 DMD遺傳優(yōu)生發(fā)展趨勢

圖2 DMD產前診斷實施流程圖

盡管侵入性的產前診斷方式已十分成熟，但現(xiàn)實中，仍有部分母體或胎兒在取樣過程或鑒定為患癥胎兒后實施的引產術中發(fā)生損害。因而，如何在優(yōu)生過程中盡可能減少對母胎的影響是近階段胎兒醫(yī)學研究的重點之一。這其中，無創(chuàng)產前診斷及植入前診斷是這一領域中有望獲得突破的兩個領域。

5.1 無創(chuàng)產前診斷 所謂無創(chuàng)產前診斷，是指采用抽取孕婦外周血等非侵入性方式獲取胎兒的遺傳物質、并對其進行遺傳分析的技術手段。根據獲得的胎兒遺傳物質的類型，從孕婦循環(huán)血液中可供分離的胎兒遺傳物質包括胎兒有核紅細胞（nucleated red blood cells，NRBCs）及胎兒游離DNA片段這兩類。兩者之中，由于胎兒有核紅細胞中包含有完整的胎兒遺傳信息，因而在高通量測序技術出現(xiàn)之前是無創(chuàng)產前診斷研究的重要方向［25］。然而時至今日，胎兒有核紅細胞的富集技術一直未獲得實質性的突破，故短期間該技術難以被應用于臨床。與此同時，高通量測序技術在近十年來取得突飛猛進的發(fā)展，并且在檢測成本上已趨近于患者可接受的水平。近年來，應用高通量測序對胎游離DNA的分析已成為DMD無創(chuàng)產前檢測研究領域的新動向［26］。事實上，針對部分染色體非整倍體異常的高通量測序無創(chuàng)產前篩查項目，近年已在國內獲得了廣泛的關注和應用，預計在不遠的將來，該技術也有望在DMD的無創(chuàng)產前檢測中實現(xiàn)突破。

5.2 植入前診斷 無論是侵入性還是無創(chuàng)產前診斷，對胎兒基因型的確診仍需在胚胎發(fā)育到一定階段之后。如經診斷發(fā)現(xiàn)胎兒基因存在缺陷，孕婦需面臨因終止妊娠而產生的身體及心理的雙重傷害。因此，對孕產婦及其家屬而言，如何避免胎兒攜帶缺陷基因更具有現(xiàn)實意義。植入前診斷是有望解決這一現(xiàn)實問題的最佳手段，目前已有一些機構已經開始嘗試DMD的植入前診斷研究并取得功［27］，隨著成果的不斷深入，相信這一領域的成果也終將為DMD的防控帶來根本性的解決之道。

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2015-02-06）

編輯：宋文穎

10.13470／j.cnki.cjpd.2015.02.017

*通訊作者：周裕林，E-mail：yulin＿zhou＠126.com