李鳳霞 王鳳儒 李宏偉

①黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥劑科 黑龍江 哈爾濱 150040

②哈爾濱三聯藥業(yè)股份有限公司 黑龍江 哈爾濱 150025

注射劑系指藥物與適宜的溶劑或分散介質制成的供注入人體內的溶液、乳狀液或混懸液及供臨用前配制或稀釋成溶液。甲硝唑注射液是甲硝唑加氯化鈉適量使成等滲的滅菌水溶液，是我國藥品中重要制劑之一，臨床使用非常廣泛[1-2]。新醫(yī)藥改革的逐漸落實，藥品新版良好生產規(guī)范(good manufacturing practice，GMP)[3]與國際標準的接軌，根據歐盟風險決策樹的要求，無菌注射劑產品應該使用終端滅菌法，首選風險安全級別最高的過度殺滅法(121 ℃，15 min)，如果藥物不能耐受121 ℃的高溫，則可以選擇殘存概率滅菌法(115 ℃，30 min)，對于溫度敏感的制劑可選擇無菌生產工藝[4-5]。

甲硝唑注射液是硝基咪唑的衍生物，是一類廣譜抗生素[6-7]。甲硝唑注射液在人體中通過還原生成具有代謝物抗厭氧菌作用，抑制細菌的脫氧核糖核酸的合成，從而干擾細菌的生長、繁殖，最終致細菌死亡[8-9]。甲硝唑制劑在臨床上主要用于預防和治療厭氧菌引起的感染，如敏感菌引起的呼吸道、消化道、腹腔及盆腔化膿性感染，皮膚軟組織、骨關節(jié)等部位的感染以及脆弱擬桿菌引起的心內膜炎、敗血癥及腦膜炎等[10-12]。本研究以甲硝唑注射液中的活性成份甲硝唑的含量為檢測指標，分析不同滅菌參數對甲硝唑含量的影響，從而篩選出適用于甲硝唑注射液的最優(yōu)的滅菌工藝參數。

1 材料及方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀；甲硝唑標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100191-200305；CAS 443-48-1)；甲硝唑注射液(規(guī)格250 ml:500 mg；國內A藥廠；批號：130401、130402、130403；130401-1、130402-1、130403-1；130401-2、130402-2、130403-2)；流動相：水(雙蒸水)，甲醇(80:20)，其他試劑級別為色譜純。

1.2 對照品溶液的制備

精密量取甲硝唑標準品1.0 mg，加流動相溶解，并精密配制成0.25 mg/ml的標準品溶液。

1.3 樣品的制備方法

分別稱取甲硝唑適量，配置成濃度為0.5%藥液為滅菌前藥液，批號為130401、130402、130403備用；取1/3滅菌前藥液經過度殺滅，可得藥液，批號為130401-1、130402-1、130403-1備用；取1/3滅菌前藥液經殘存概率滅菌法，可得藥液，批號為130401-2、130402-2、130403-2備用。

(1)未滅菌藥液的制備。稱取甲硝唑50 g，加水至25 L攪拌20～25 min使完全溶解，經0.22 μm超濾膜過濾，灌裝，可得藥液批號為130401、130402、130403。

(2)過度殺滅藥液的制備。選用未滅菌藥液(批號130401、130402、130403)于121℃水浴滅菌15 min，對應批號為130401-1、130402-1、130403-1。

(3)殘存概率滅菌法藥液的制備。選用未滅菌藥液(批號130401、130402、130403)于115 ℃水浴滅菌30 min，對應批號為130401-2、130402-2、130403-2。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水，甲醇(80∶20)；流速為1.5 ml/min；檢測波長λ=320 nm；進樣體積為10 μL；保留時間為10 min。

2 結果

2.1 系統適應性與線性關系

(1)理論塔板數計算甲硝唑＞2000。

(2)將甲硝唑標準品溶液(0.25 mg/ml)逐漸稀釋成濃度分別為21.90 μg/ml、43.80 μg/ml、87.63 μg/ml、175.25 μg/ml、350.50 μg/ml和701.00 μg/ml的溶液。每個濃度進樣10 μl，在上述色譜條件下分析，以峰面積平均值對其相對應的濃度建立回歸方程。以相應峰面積Y對其進樣濃度X(μg/ml)進行線性回歸，得線性方程為：Y=56.78X+997.02(r=0.9999)。線性關系為21.90～701.00 μg/ml范圍內，良好。

2.2 溶液穩(wěn)定性

精密量取甲硝唑對照品溶液(0.25 mg/ml)，在0 h和24 h分別進樣，在上述色譜條件下分析，計算其峰面積相對標準偏差RSD為1.03%，甲硝唑注射液在24 h溶液穩(wěn)定。

2.3 精密度

精密量取甲硝唑對照品溶液(0.25 mg/ml)，在上述色譜條件下，重復進樣6次，計算其峰面積相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)(精密度)為1.00%，表明甲硝唑注射液精密度良好。

2.4 回收率

精密量取甲硝唑注射液濃度已測定樣品3份，每份1 ml，分別向其中加入甲硝唑標準液(0.25 mg/ml)0.5 ml、1 ml和1.5 ml作供試品溶液。搖勻進樣，每組3次，測定加樣后溶液中甲硝唑濃度與加樣前溶液中甲硝唑濃度，測得甲硝唑注射液中甲硝唑的加樣回收率平均99.76%，RSD值為1.21%。

2.5 檢測線與定量限

取甲硝唑標準品(0.25 mg/ml)適量，逐步稀釋，S/N=10為定量限，S/N=3檢測線，試驗結果定量限為0.6 μg/ml，檢測線為0.2 μg/ml。

2.6 甲硝唑含量測定

取滅菌前藥液、過度殺滅藥液及殘存概率滅菌藥液制備樣品，按上述色譜條件測定，各平行重復測定2次，求其峰面積的平均值，并通過回歸方程計算樣品甲硝唑注射液中甲硝唑含量。測定滅菌前藥液甲硝唑含量分別為101.2%、102.0%及101.5%，采用過度殺菌法滅菌之后藥液含量分別為101.0%、101.9%、101.5%，測定采用殘存概率法滅菌后甲硝唑含量分別為101.3%、102.0%、101.5%(見表1)。

表1 甲硝唑樣品含量測定試驗結果

3 討論

根據歐洲藥典和“CPMP指南備注”的規(guī)定，無菌產品應在灌裝到最終容器中之后進行終端滅菌。本研究對幾種可供選擇的滅菌條件進行優(yōu)選，結合品種特性，以實際的研究結果證實滅菌工藝條件選擇的合理性。只要條件允許，應首選過度殺滅滅菌工藝，因該工藝的無菌保證安全性高，對工藝全過程的控制要求相對較低，只要該藥品是嚴格按照GMP的要求組織生產，即可確保無菌保證值達到≤10-6，而不必擔心裝載的生物負荷和耐熱性。殘存概率滅菌工藝則是從滅菌前微生物污染控制和滅菌過程控制兩方面入手，使得滅菌F0值較低的情況下也能確保達到藥典規(guī)定的無菌保證水平。但需注意到，某些產品在提高滅菌溫度而縮短滅菌時間后，產生的雜質可能會有所降低，故要結合藥物的具體情況，考察和評價所選滅菌程序對藥物質量的實際影響[13-15]。

通過對甲硝唑注射液滅菌前3批藥液含量、不同滅菌參數甲硝唑含量進行測定，按照上述經過驗證的方法進行檢測，發(fā)現3批滅菌藥液標示量的含量變化不大。實驗證明，甲硝唑注射液采用過度殺滅法、殘存概率滅菌法滅菌后藥液含量差別不大，表明甲硝唑注射液可以耐受終端過度滅菌法。按照歐盟風險決策樹要求，為了保證注射劑產品的安全性，生產中應優(yōu)先選擇終端過渡滅菌法，并考慮滅菌耐受性，選擇活性成分含量作為依據，本研究表明，高效液相測定法快速、準確，且操作方便。

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