魏林郁，李新娟，梅懿文，王國紅，王 琪，李東亮，李超堃△

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)研究室，河南 新鄉(xiāng) 453003;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

雙孔道鉀通道(tandem pore domain K channel，K2P)編碼細(xì)胞的背景鉀電流，是靜息電位形成的主要通道［1］。酸敏感鉀通道(tandem pore domain acidsensitive potassium channel，TASK)作為 K2P 家族一員，是一種酸度敏感性外向整流鉀通道。在缺血腦損傷過程中發(fā)揮重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用［2，3］。在TASK家族中，TASK3(KCNK9)為pH敏感亞基，在生理環(huán)境(pH 7.4)主要表現(xiàn)為開放狀態(tài)，只有在H+濃度較高的酸性環(huán)境中才轉(zhuǎn)變成關(guān)閉狀態(tài)［4］，其活性隨著H+濃度的升高以及氧含量降低而顯著降低［2，3］。作為鉀離子通道，主要通過調(diào)節(jié)膜靜息電位水平從而調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，以阻止過度鉀外流引發(fā)的細(xì)胞滲透壓平衡紊亂所造成的細(xì)胞死亡［5］。研究表明，缺血引發(fā)的酸化過程中 TASK3 K+通道由缺血前的開放狀態(tài)逐步變成關(guān)閉狀態(tài)是引發(fā)神經(jīng)元去極化的主要誘因之一。

目前TASK3蛋白在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系中表達(dá)豐度普遍極低，使得利用體外培養(yǎng)細(xì)胞研究TASK3的功能成為難點(diǎn)。本研究旨在克隆人腦組織TASK3基因，對(duì)TASK3 C末端進(jìn)行綠色熒光蛋白(eGFP)融合，構(gòu)建TASK3重組真核表達(dá)載體;將其轉(zhuǎn)染至人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)中，建立穩(wěn)定過表達(dá)TASK3的細(xì)胞株，為體外研究TASK3通道功能提供細(xì)胞模型，也為進(jìn)一步探討TASK3通道在腦缺血酸化誘發(fā)神經(jīng)損傷的分子機(jī)制，尋找藥物治療腦缺血損傷的新靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人腦組織TASK3(KCNK9)全長(zhǎng)cDNA購自美國Open Biosystems公司;SH-SY5Y細(xì)胞，購于中科院上海細(xì)胞庫;pEGFP-N1載體購于GENECHEM公司;感受態(tài)大腸桿菌DH5a購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 主要試劑

胎牛血清購自美國Hyclone公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;X-fect轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Clontech公司;PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶QuickCut DpnI購自日本TaKa-Ra公司;去內(nèi)毒素質(zhì)粒小抽試劑盒購自美國OMEGA公司;TASK3兔抗大鼠多克隆一抗購自美國Sigma Aldrich公司;LB培養(yǎng)基、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE電泳液、Western blot轉(zhuǎn)膜液、牛血清白蛋白BSA、GAPDH兔抗大鼠多克隆一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗購自碧云天生物技術(shù)研究所;RTPCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(KCNK9上游引物:5’-CGTCAGATCCGCTAGCGCCACCATGAAGAGGCAGAACGTGCGGAC-3’;KCNK9下游引物:5’-CGCCCTTGCTCACCATAACG GACTTCCGGCGTTTCA-3’;pEGFP-N1 引物:N1-end-FWD:5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’;N1-start-REV:5’-GCTAGCGGATCTGACGGTTCAC-3’;pEGFP-N1 測(cè)序引物:N1-Seq FWD:5’-TGGGAGT TTGTTTTGGCAC-3’;N1-Seq REV:5’-GGACACGCTGAACTTGT GG-3’)。

1.3 TASK3基因亞克隆及pEGFP-N1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用李超等［6］快速克隆方法，亞克隆TASK3基因到真核表達(dá)載體pEGFP-N1。利用PCR擴(kuò)增TASK3基因。引 物 如 下:KCNK9-FWD:5’-CGTCAGATCCGCTAGCGCCACCATGAAGAGGCAGAACGTGCG GAC-3’;KCNK9-REV:5’-CGCCCTTGCTCACCATAAC GGACTTCCGGCGTTTCA-3’，下劃線為去除終止密碼子的TASK3開放閱讀框，其余序列是同pEGFP-N1進(jìn)行融合的互補(bǔ)的16個(gè)堿基的重疊序列。同時(shí)，利用PCR反向擴(kuò)增pEGFP-N1載體，引物如下:N1-end-FWD:5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’;N1-start-REV:5’-GCTAGCGGATCTGACGGTTCAC-3’。PCR反應(yīng)體系如下:5 x Phusion 擴(kuò)增緩沖液10μl，2.5 mmol/L dNTP 6μl，上游引物(5μmol/L)1μl，下游引物(5μmol/L)1μl，模板(10ng/μl)1μl，Phusion DNA 聚合酶 0.5μl，補(bǔ)充滅菌水至50μl，瞬時(shí)離心混勻。PCR反應(yīng)參數(shù):98℃ 2 min;98℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 90s，共18 個(gè)循環(huán);72℃再延伸5 min后冷卻至4℃。反應(yīng)完成后1%瓊脂糖電泳檢測(cè)TASK3和pEGFP-N1載體PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物檢測(cè)正確后，在PCR產(chǎn)物中直接加入1μl DpnI，瞬時(shí)混合后在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化3 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟:5μl消化后pEGFP-N1和TASK3擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行混合，室溫放置30min，取2μl混合產(chǎn)物加入到100μl DH5a感受態(tài)細(xì)胞中冰浴30min，再進(jìn)行42℃熱激處理60s，0℃冰浴60s，最后在無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中恢復(fù)1 h后，均勻涂布于含100μg/ml的氨芐抗性LB固體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)15～18 h。

1.4 重組質(zhì)粒的鑒定和提取

在含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取6個(gè)單克隆菌落，放置于5 ml含有50μg/ml氨芐的培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，隨后使用TASK3引物做菌液PCR鑒定TASK3陽性克隆。菌液PCR反應(yīng)參數(shù):94℃ 5 min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2 min，共25個(gè)循環(huán);72℃再延伸10min后冷卻至4℃。反應(yīng)完成進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。選取能擴(kuò)增出約1.2 kb TASK3條帶的克隆，按照OMEGA公司無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒抽提;將同一陽性克隆菌液送至北京英俊公司用pEGFP-N1測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。重組質(zhì)粒命名為pEGFP-TASK3。

1.5 建立穩(wěn)定表達(dá)TASK3-eGFP的SH-SY5Y細(xì)胞株

SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到50% ～60%時(shí)，按照美國Clontech公司的x-fect轉(zhuǎn)染試劑盒說明書書將pEGFP-TASK3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞。4h后換正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后熒光顯微鏡觀察重組蛋白的表達(dá)情況，72 h后胰酶消化轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行488 nm熒光激發(fā)，篩選帶綠色熒光的陽性細(xì)胞，將其植入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2周，使用含 G418(600mg/L)的選擇性培養(yǎng)基篩選耐藥且能表達(dá)綠色熒光蛋白的克隆，48 h換液1次。2周后熒光顯微鏡觀察篩選綠色熒光細(xì)胞，用胰酶消化分散細(xì)胞，梯度稀釋至終濃度為每10ml培養(yǎng)基中含100個(gè)細(xì)胞。取100μl接種培養(yǎng)基至96孔板內(nèi)，確保96孔板每孔中1個(gè)細(xì)胞，同時(shí)做2個(gè)96孔板的平行接種。使用含G418(600μg/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞2周，48 h換液1次。熒光顯微鏡鑒定獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.6 激光共聚焦觀察TASK3-eGFP的細(xì)胞表達(dá)

將穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的SH-SY5Y細(xì)胞株接種于活細(xì)胞成像培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁培養(yǎng)48 h后，置細(xì)胞成像培養(yǎng)皿于激光共聚焦顯微鏡下做40倍熒光觀察。使用層掃描對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及野生型SHSY5Y細(xì)胞進(jìn)行熒光定位。

1.7 Western blot檢測(cè)TASK3-eGFP的表達(dá)

選取熒光顯微鏡觀察到的帶綠色熒光的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞去除培養(yǎng)基，PBS洗1遍，經(jīng)RIPA裂解液裂解輔助超聲破碎細(xì)胞，4℃離心機(jī)12000x g離心10min，收集上清，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取含40μg細(xì)胞蛋白的提取液，加樣品緩沖液煮沸變性，10%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上，3%BSA 37℃封閉1 h，隨后加入兔抗大鼠TASK3一抗(1∶1000)4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，再與堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1000)37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，硝酸纖維素膜用BCIP/NBT顯色系統(tǒng)顯色，以兔抗大鼠GAPDH一抗為內(nèi)參照。

1.8 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)期SH-SY5Y細(xì)胞以2×104cells/well接種于96孔塑料培養(yǎng)板中，每孔加入100μl培養(yǎng)基;24h后棄去培養(yǎng)基，分別加入不同pH值(7.0、6.7、6.4、6.1)培養(yǎng)基 200μl處理 24h，野生型 SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)照組和穩(wěn)定表達(dá)TASK3-eGFP的SH-SY5Y實(shí)驗(yàn)組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。處理因素完成后，每孔加入10μl CCK-8，37℃孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀 450nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度(A)值。按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增TASK3基因和重組質(zhì)粒pEGFPTASK3的鑒定

以人腦組織TASK3 cDNA和真核pEGFP-N1載體為模板，利用TASK3引物和pEGFP-N1反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見在約1.2 kb和4.7 kb處各有1條帶，分別與預(yù)計(jì)目的條帶TASK3和pEGFP-N1大小位置相符(圖1a)。兩種PCR產(chǎn)物1∶1混合并用DpnI消化過夜，再轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，接種至含卡那霉素的LB瓊脂糖培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑選6個(gè)單克隆菌落，進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，除第4泳道外，其余5個(gè)泳道均可見約1.2 kb處有1條帶，與目的條帶TASK3位置符合(圖1b)。

Fig.1 TASK3 cDNA amplified by PCR and identification of recombinant plasmid pEGFP-TASK3

2.2 TASK3-eGFP在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞株的細(xì)胞膜定位

TASK3鉀離子通道是一種膜蛋白，主要表達(dá)在細(xì)胞膜上。對(duì)TASK3 C末端進(jìn)行綠色熒光蛋白(eGFP)融合，利用激光共聚焦顯微鏡層掃描鑒定TASK3-eGFP在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞系中的表達(dá)。結(jié)果顯示，正常SH-SY5Y細(xì)胞無綠色熒光(圖2b);而表達(dá)TASK3-eGFP的SH-SY5Y細(xì)胞中，僅在細(xì)胞膜上顯示綠色熒光，胞漿和胞核綠色熒光顯示陰性(圖2d)。

Fig.2 Surface localization of TASK3-eGFP in SH-SY5Y cells by confocal microscopy

2.3 Western blot檢測(cè)TASK3-eGFP蛋白的表達(dá)

用TASK3抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，SH-SY5Y-eGFP tag-TASK3細(xì)胞系樣品對(duì)應(yīng)泳道均可見在約73 kDa(TASK3-eGFP)處有明顯的免疫雜交條帶，而野生型SH-SY5Y細(xì)胞樣品對(duì)應(yīng)泳道未見陽性條帶(圖3)。

Fig.3 Expression of fusion protein TASK3 tagged with eGFP in SH-SY5Y cells

2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示:不同pH 值(7.0、6.7、6.4、6.1)培養(yǎng)基處理 SH-SY5Y 細(xì)胞24h后，野生型SH-SY5Y細(xì)胞存活率分別是(100±1.2)%、(87.2±1.5)%、(62.5±3.2)%、(46.5±1.6)%;轉(zhuǎn)染TASK3的SH-SY5Y細(xì)胞存活率分別是(100±0.8)%、(94.5±3.1)%、(74.5±5.3)%、(55.7±2.4)%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組細(xì)胞的存活率隨著pH值降低而顯著性降低(P＜0.05)。相同pH值下(除pH 7.0)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率顯著性高于野生型細(xì)胞(P＜0.05)。

Fig.4 Cell viability of SH-SY5Y measured with CCK-8 assay(，n=6)

3 討論

TASK3 K+通道作為TASK家族pH敏感亞型，廣泛分布于腦中，主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜靜息電位水平而調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。當(dāng)細(xì)胞外pH值從7.2降至6.4和6.0時(shí)，TASK3電流分別被抑制74%和96%，以阻止過度鉀外流引發(fā)的細(xì)胞滲透壓平衡紊亂所造成的細(xì)胞死亡。近年來研究證實(shí)，TASK3 通道參與腦缺血的發(fā)生過程［3，8］。腦缺血時(shí)，氧供給不足，無氧酵解產(chǎn)生的乳酸及ATP水解產(chǎn)生的質(zhì)子引起酸毒癥，腦組織pH值可降至6.0～6.5［7］，TASK3通道由缺血前的開放狀態(tài)逐步蛻變成關(guān)閉狀態(tài)，造成神經(jīng)元去極化。而去極化作用將極大促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)及小肽物質(zhì)的過度釋放，過多的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放又加重TASK3誘導(dǎo)的膜去極化作用，但具體分子機(jī)制還不清楚。目前，在體研究TASK3在腦缺血損傷中的作用更多在TASK3基因敲除(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物進(jìn)行。然而由于培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TASK3水平較低，使得體外深入研究TASK3功能受到限制。

本實(shí)驗(yàn)欲通過亞克隆TASK3基因到真核表達(dá)載體pEGFP-N1，利用轉(zhuǎn)染方法在SH-SY5Y細(xì)胞中過表達(dá)TASK3蛋白，為進(jìn)一步探討TASK3對(duì)腦缺血損傷可能的作用及機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中，利用pEGFP-N1質(zhì)粒(帶綠色熒光蛋白的報(bào)告載體)、采用雙酶切定向克隆的方式(避免自連和反向連接)構(gòu)建TASK3重組真核表達(dá)載體。pEGFP-N1包含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因EGFP，由于細(xì)胞本身沒有EGFP基因，將EGFP和另一基因的編碼區(qū)相連得到融合體，可以研究目的蛋白的定位，其熒光強(qiáng)弱取決于蛋白的含量，GFP與外源基因偶聯(lián)時(shí)一般不影響外源蛋白的構(gòu)象和功能，可為應(yīng)用流式細(xì)胞篩選或其他方式對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)EGFP及目的蛋白的有效率提供一個(gè)依據(jù)［9］;含有高效的功能強(qiáng)大的啟動(dòng)子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá);結(jié)構(gòu)上，該質(zhì)粒具有很強(qiáng)的復(fù)制能力，可以滿足宿主細(xì)胞分裂時(shí)跟隨細(xì)胞質(zhì)遺傳給新生的子細(xì)胞，這是保證目的基因穩(wěn)定表達(dá)的因素之一;具有新霉素抗性(neo)基因，可以采用G418來篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體的靶細(xì)胞。此外，采用含Ampi的LB選擇性培養(yǎng)基篩選含Ampi轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，并經(jīng)過酶切初步鑒定克隆正確，最后經(jīng)過DNA測(cè)序分析確定所插入的目的基因片段的正確性。

本研究利用pEGFP-N1質(zhì)粒的特性，使用流式細(xì)胞儀篩選出瞬時(shí)轉(zhuǎn)染帶綠色熒光的TASK3陽性細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后接種在96孔板中使每孔僅有1個(gè)陽性細(xì)胞，確保表達(dá)TASK3細(xì)胞株的穩(wěn)定傳代;利用Western blot檢測(cè)出該穩(wěn)定細(xì)胞株TASK3蛋白的高表達(dá);激光共聚焦顯微術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了EGFP綠色熒光蛋白同TASK3蛋白融合后主要定位在細(xì)胞膜上，實(shí)現(xiàn)對(duì)TASK3標(biāo)記和示蹤;利用CCK-8檢測(cè)不同pH值作用穩(wěn)定細(xì)胞株24h后的存活率，從功能上證實(shí)穩(wěn)定細(xì)胞株中TASK3通道具有酸敏感性。因此，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)TASK3-eGFP蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞株，并為體外研究TASK3功能提供細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。TASK3也有望成為缺血性腦病發(fā)生的分子生物學(xué)治療靶點(diǎn)，深入研究TASK3或許可為腦缺血損傷的臨床防治提供新策略。

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