鄭揚(yáng) 夏輝 趙雁林

?

·論著·

TREK Sensititre?MYCOTB檢測結(jié)核分枝桿菌對一、二線抗結(jié)核藥物的敏感性研究

鄭揚(yáng) 夏輝 趙雁林

目的 本研究旨在評價(jià)TREK Sensititre?MYCOTB(簡稱“MYCOTB”；一種含有一、二線抗結(jié)核藥物凍干粉的商品化藥敏板)檢測一、二線抗結(jié)核藥物的敏感性的效能。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法選取來自國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室的151株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，采用MYCOTB方法對一、二線抗結(jié)核藥物[包括氧氟沙星(ofloxacin，Ofx)、莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)、利福平(rifampin，RFP)、阿米卡星(amikacin，Am)、鏈霉素(streptomycin，Sm)、利福布汀(rifabutin，Rfb)、對氨基水楊酸(para-aminosalicylic acid，PAS)、乙硫異煙胺(ethionamide，Eto)、環(huán)絲氨酸(cycloserine，Cs)、異煙肼(isoniazid，INH)、卡那霉素(kanamycin，Km)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)]進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)。并使用Middlebrook 7H10瓊脂比例法(APM)作為對照，研究評估MYCOTB的敏感度、特異度、可行性及兩種藥敏試驗(yàn)方法的一致率。結(jié)果 8/12種藥物(Ofx、Mfx、RFP、Sm、Rfb、Eto、Km及EMB)的敏感度≥90%，其余4種藥物除Cs外，敏感度均≥80%。另外，除Rfb的特異度為86.8%外，其余藥物的特異度均≥90%。9/12種藥物(Ofx、Mfx、RFP、Am、Sm、PAS、Eto、Cs及Km)MYCOTB和APM的絕對一致率≥94%。10/12種藥物(Ofx、Mfx、RFP、Am、Sm、PAS、Eto、Cs、Km及EMB)的 MYCOTB和APM的條件一致率≥96%。MYCOTB的平均判讀時(shí)間為10 d，10/12種藥物(Ofx、Mfx、RFP、Am、Sm、Rfb、PAS、Eto及EMB)雙人判讀的一致率≥94%。 結(jié)論 MYCOTB方法檢測Mtb對一、二線抗結(jié)核藥物的敏感性試驗(yàn)是可行、可靠的。

結(jié)核分枝桿菌； 抗藥性, 細(xì)菌； 微生物敏感性試驗(yàn)； 抗生素類, 抗結(jié)核

結(jié)核病是一種經(jīng)呼吸道傳播的慢性傳染病，在全球廣泛流行[1-2]。結(jié)核分枝桿菌對藥物的敏感性檢測對于個(gè)體患者管理及整體結(jié)核病控制都起著十分重要的作用。就目前而言，基因型相關(guān)的分子生物學(xué)耐藥檢測方法雖然存在時(shí)間較短的優(yōu)勢，但對于各類抗結(jié)核藥物，其耐藥突變位點(diǎn)的研究尚不全面，因此，耐藥表型的研究方法仍然十分重要[3-6]。

TREK Sensititre?MYCOTB(簡稱“MYCOTB”，賽默飛公司產(chǎn)品，美國)是含有12種一、二線抗結(jié)核藥物凍干粉的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)藥敏板。目前，關(guān)于此方法檢測耐藥結(jié)核病的文獻(xiàn)還比較少。之前有相關(guān)研究表明，MIC藥敏板和固體藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)的一致性較好[7-8]。本研究擬評估MYCOTB方法在我國應(yīng)用的效果。

對象和方法

一、實(shí)驗(yàn)對象

采用數(shù)字表法隨機(jī)選取國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室保藏的2007年全國結(jié)核病耐藥監(jiān)測的MDR和非MDR菌株共155株。凍存菌株接種到羅氏固體培養(yǎng)基上，其中4株傳代失敗，其余生長良好的151株菌株在其對數(shù)生長期時(shí)，進(jìn)行12種一線及二線抗結(jié)核藥(包括Ofx、Mfx、RFP、Am、Sm、Rfb、PAS、Eto、Cs、INH、Km、 EMB)的藥敏試驗(yàn)。

二、MYCOTB操作流程

實(shí)驗(yàn)按照廠家操作手冊進(jìn)行。制備0.5 McFarland單位的菌懸液。取100 μl的菌懸液至11 ml Middlebrook 7H9培養(yǎng)基中混勻，分裝到96孔MYCOTB藥敏板中，每孔100 μl。完成后將 MYCOTB板貼上封膜，放置在37 ℃ 5% CO2的溫箱中孵育。

分別于7、10、14和21 d使用臺式的觀察鏡判讀結(jié)果。MYCOTB以對照孔生長為判讀時(shí)間點(diǎn)。每個(gè)藥敏板都由雙人判讀，結(jié)果以第1人的判讀為準(zhǔn)，第2人的判讀結(jié)果用于評估兩人判讀結(jié)果的一致性。

三、Middlebrook 7H10瓊脂比例法(APM) 操作流程

按照操作流程制備7H10瓊脂平板[9]。生長好的菌株制備成1.0 McFarland單位的菌懸液，分別進(jìn)行10-2和10-4倍稀釋，將10-2倍稀釋度的菌液加入到對照孔，10-4倍稀釋度的菌液加入到剩余所有含藥孔中，菌液均勻涂布于瓊脂面上，室溫孵育至菌液吸收后，移至37 ℃ 5% CO2的溫箱中孵育。3周后觀察平板菌株生長情況判定結(jié)果。APM的臨界濃度見表1。

四、測序分析

對耐藥基因位點(diǎn)比較清晰的幾種藥物，在MYCOTB和APM結(jié)果不一致時(shí)進(jìn)行耐藥基因測序分析[10-13]。RFP 的耐藥相關(guān)基因?yàn)閞poB，Am的耐藥相關(guān)基因?yàn)閞rs，INH的耐藥相關(guān)基因?yàn)閗atG和inhA，Sm的耐藥相關(guān)基因?yàn)閞psl、rrs和gidB， 氟喹諾酮類藥物(Mfx，Ofx)的耐藥相關(guān)基因?yàn)間yrA和gyrB。

五、相關(guān)定義

1.絕對一致率： 當(dāng)MYCOTB的MIC值≤APM臨界值濃度時(shí)，MYCOTB判斷為敏感， 當(dāng)MYCOTB的MIC值>APM臨界值濃度時(shí)，MYCOTB判斷為耐藥，以此敏感或耐藥標(biāo)準(zhǔn)，若兩種方法結(jié)果均為耐藥或敏感則兩種方法結(jié)果為絕對一致。

2.條件一致率： 若APM為敏感，則MYCOTB的MIC值≤APM臨界值濃度加一個(gè)稀釋度時(shí)，MYCOTB判斷為敏感；若APM耐藥，則MYCOTB的MIC值≥APM臨界值濃度時(shí)，MYCOTB判斷為耐藥，以此敏感或耐藥標(biāo)準(zhǔn)，若兩種方法均為耐藥或敏感則兩種方法為條件一致。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以APM為參考標(biāo)準(zhǔn)，分析MYCOTB藥敏試驗(yàn)的敏感度、特異度、一致率，并計(jì)算MYCOTB的敏感度和特異度的95%可信區(qū)間。以耐藥、敏感分類進(jìn)行雙人判讀的比較分析。

結(jié) 果

一、APM藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析

APM方法檢出各種藥物的耐藥比率：Ofx為 13.2%(20/151)；Mfx低濃度(Mfx-L)(0.5 μg/ml)時(shí)為12.6%(19/151)，高濃度(Mfx-H)(2 μg/ml)時(shí)為1.3%(2/151)； RFP為 65.6%(99/151)； Am為 6.0%(9/151)；Sm低濃度(Sm-L)(2 μg/ml)時(shí)為51.0%(77/151)，高濃度(Sm-H)(10 μg/ml)時(shí)為36.4%(55/151)；Rfb 為49.7%(75/151)；PAS為 4.6%(7/151)；Eto 為17.2%(26/151)；Cs為 1.3%(2/151)；INH低濃度(INH-L)(0.2 μg/ml)時(shí)為74.8%(113/151)，高濃度(INH-H)(1 μg/ml)時(shí)為66.9%(101/151)；Km為 6.0%(9/151)；EMB低濃度(EMB-L)(5 μg/ml)時(shí)為19.2%(29/151)，高濃度(EMB-H)(10 μg/ml)時(shí)為0.7%(1/151)。其中68.2%(103/151)為MDR菌株，22.5%(34/151)的菌株對所有藥物均敏感，3.3%(5/151)為XDR菌株，3.3%(5/151)為單耐藥菌株，6.0%(9/151)為多耐藥菌株。

二、APM 和MYCOTB藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致率的比較

5/12種藥物包括INH-L (100.0%，151/151)、Km(100.0%，151/151)、Am(99.3%，150/151)、Eto (98.0%，148/151)、RFP(97.4%，147/151)，APM和 MYCOTBI兩種藥敏試驗(yàn)方法絕對一致率較高。 對于EMB-H(93.4%，141/151)、Rfb(91.4%，138/151)、INH-H (86.8%，131/151) 3種藥物，絕對一致率相對較低。從條件一致率看，除了INH-H(93.4%，141/151)和Rfb(94.0%，142/151)外，其他藥物在兩種藥敏試驗(yàn)方法上的一致率均≥96%，具體見表1。

三、以APM結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)MYCOTB檢測的敏感度和特異度分析

從表1可以看出，MYCOTB檢測Ofx、Mfx-H、RFP、Rfb、Eto、INH-L、Km、EMB-H和EMB-L及Sm-H時(shí)敏感度在95%以上；Mfx-L和Sm-L的敏感度在90%以上；Am、PAS和INH-H的敏感度在80%以上；Cs的敏感度為50%。除Rfb特異度低于90%外，MYCOTB檢測其他藥物的特異度均高于90%。

四、不一致結(jié)果分析

APM和 MYCOTB檢測結(jié)果不一致的測序分析結(jié)果見表2。 在APM敏感但MYCOTB耐藥的菌株中，有81.5%(44/54)的耐藥基因發(fā)生了突變；在APM耐藥但MYCOTB敏感的4株菌株中，耐藥基因都發(fā)生了突變。

表1 對一、二線抗結(jié)核藥物以APM為參考標(biāo)準(zhǔn)采用MYCOTB檢測的敏感度、特異度及一致率分析

續(xù)表1

注a：敏感度=APM耐藥且MYCOTB耐藥株數(shù)/APM耐藥株數(shù)×100%；b：特異度=APM敏感且MYCOTB敏感株數(shù)/APM敏感株數(shù)×100%；c：一致率=兩種方法均為耐藥的株數(shù)+兩種方法均為敏感的株數(shù)/檢測總株數(shù)×100%

表2 不同藥物藥敏試驗(yàn)APM和 MYCOTB檢測不一致的菌株耐藥基因測序結(jié)果(株數(shù))

注a：突變型是指由野生型基因突變而來，表現(xiàn)變異的基因；b：野生型是指自然群體中出現(xiàn)最多的基因類型；c：INH-H共有19株進(jìn)行測序，其中有1株無測序結(jié)果

五、MYCOTB可行性及雙人判讀一致率

MYCOTB的平均判讀時(shí)間為10 d，APM的平均判讀時(shí)間為21 d。對151株菌株、12種藥物以耐藥或敏感進(jìn)行分類判讀，其雙人一致率為95.9%(2173/2265)(表3)。

表3 不同藥物MYCOTB檢測結(jié)果雙人判讀的一致率

討 論

我國廣泛使用的改良羅氏固體培養(yǎng)基藥敏試驗(yàn)存在結(jié)果報(bào)告周期長、在一些地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室中缺乏儲存藥物和培養(yǎng)基等問題；而對于部分抗結(jié)核藥物，分子生物學(xué)的研究已經(jīng)表明，不同的耐藥突變位點(diǎn)對應(yīng)不同的最低抑菌濃度，這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了細(xì)菌因素在藥物動(dòng)力學(xué)和最佳治療方案上的重要性。因此，MYCOTB存在良好的前景和技術(shù)上的優(yōu)勢。

一、以APM為參考標(biāo)準(zhǔn)評估MYCOTB檢測的敏感度、特異度及一致率分析

研究表明，以絕對一致率來判斷，其中有9(9/12)種藥物的MYCOTB和APM的一致率≥96%。而以條件一致率來判斷，其中9(9/12)種藥物的 MYCOTB和APM的一致率≥98%，其余藥物的一致率均>90%。Lee等[7]已發(fā)表的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示7/12種藥物的 MYCOTB和APM檢測的絕對一致率≥92%， 10/12種藥物的 MYCOTB和APM檢測的條件一致率≥96%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本研究相似[7-8]。筆者也發(fā)現(xiàn)對于 MYCOTB，一些藥物APM的臨界濃度并未包含在MYCOTB板中，例如INH-L、RFP、Sm-H及Cs，因此如果簡單以APM臨界濃度來定義MYCOTB結(jié)果為“敏感”和“耐藥”，在一些情況下，可能造成MYCOTB對耐藥或敏感結(jié)果的判斷錯(cuò)誤。所以，筆者根據(jù)文獻(xiàn)提出了一個(gè)更為寬松的參數(shù)即條件一致率， 以此來更好地理解數(shù)據(jù)。從結(jié)果中可知， MYCOTB對于大部分藥物(9/12)的敏感性試驗(yàn)結(jié)果的一致率由原來的96%提高至98%，尤其對于Ofx、RFP、Am、PAS、Eto、Km，結(jié)果呈現(xiàn)較好的一致性。

MYCOTB檢測對于大部分藥物的敏感度和特異度都≥90%。但對于Cs，其敏感度僅為50%，其主要原因是APM檢測結(jié)果為耐藥的菌株僅為2株，MYCOTB檢測結(jié)果為1株耐藥，1株敏感，由于耐藥菌株數(shù)量過少不具有代表性。

二、兩種方法檢測結(jié)果不一致的基因測序分析

兩種方法檢測結(jié)果不一致的菌株表現(xiàn)為APM敏感但MYCOTB耐藥。從測序結(jié)果看，APM敏感但MYCOTB耐藥的菌株中，測序結(jié)果更支持 MYCOTB的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也就是說MYCOTB的結(jié)果更加準(zhǔn)確。文獻(xiàn)中提出與表型藥敏實(shí)驗(yàn)方法相比，通過檢測耐藥相關(guān)基因的分子方法檢測不同藥物的敏感度和特異度如下，rpoB為97.1%和93.6%，katG為85.4%和100.0%，rrs為90.0%和98.8%，inhA為16.5%和100.0%，katG和inhA一起考慮時(shí)，敏感度和特異度為85.4%和90.6%[10]。對Sm耐藥的相關(guān)基因中，rrs的突變率為25%，rpsl為50%，gidB為23%[11]。 對氟喹諾酮類藥物耐藥的相關(guān)基因?yàn)間yrA和gyrB，對于Ofx 耐藥的菌株，gyrA和gyrB基因的突變率為96%[12]。在APM耐藥但MYCOTB敏感的菌株中，測序結(jié)果均顯示發(fā)生突變，但樣本數(shù)過小，難以準(zhǔn)確說明測序結(jié)果更支持哪種實(shí)驗(yàn)方法。

三、MYCOTB的可行性分析

MYCOTB的平均判讀時(shí)間為10 d，而APM的平均判讀時(shí)間為21 d。MYCOTB相比于傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。所有菌株雙人判讀結(jié)果的一致率≥95%，一致率的差異主要來源于MYCOTB有部分菌株菌落生長較小，判讀存在一定困難。初步判斷造成這一結(jié)果的主要原因可能與接種時(shí)菌株的生長狀態(tài)有關(guān)。

四、研究的不足之處及前景應(yīng)用

本研究中還存在一些不足之處。對于數(shù)字表法隨機(jī)選擇的耐藥菌株，由于研究時(shí)間的局限性，導(dǎo)致對部分抗結(jié)核藥物耐藥的菌株樣本量較少，這可能會(huì)直接影響研究結(jié)果的判斷。

MYCOTB的主要優(yōu)勢在于可以對結(jié)核分枝桿菌同時(shí)進(jìn)行一、二線抗結(jié)核藥物的敏感性檢測，這一優(yōu)勢便于制定個(gè)體化的治療方案，為結(jié)核病診斷治療提供了一個(gè)更為全面綜合的依據(jù)。另外，MYCOTB板上固化了相應(yīng)濃度的抗結(jié)核藥物，在室溫可存放2年，從而避免了實(shí)驗(yàn)耗材準(zhǔn)備及試劑、藥物的存放問題，可以有效減少實(shí)驗(yàn)室間的差異性。將Mtb是否對INH和RFP耐藥的快速分子檢測與MYCOTB藥敏板相結(jié)合進(jìn)行檢測具有很好的前景，當(dāng)患者M(jìn)tb臨床分離株被分子快速檢測出耐藥后，可以及時(shí)進(jìn)行一、二線藥物的表型實(shí)驗(yàn)，對于結(jié)核病耐藥檢測和治療有重要意義。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2014. Geneva: World Health Organization, 2014.

[2] Zhao Y, Xu S, Wang L, et al. National survey of drug-resis-tant tuberculosis in China. N Engl J Med, 2012, 366(23)：2161-2170.

[3] Centers for Disease Control and Prevention(CDC). Emergence ofMycobacteriumtuberculosiswith extensive resistance to se-cond-line drugs-worldwide, 2000—2004. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2006, 55(11):301-305.

[4] Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med, 2010, 363(11):1005-1015.

[5] Hanrahan CF, Dorman SE, Erasmus L, et al. The impact of expanded testing for multidrug resistant tuberculosis using genotype [correction of geontype] MTBDRplus in South Africa: an observational cohort study. PLoS One, 2012, 7(11):e49898.

[6] 甄偉，石大偉，趙玉玲，等.耐多藥結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥相關(guān)基因katG突變分析. 中國防癆雜志，2013, 35(3)：207-209.

[7] Lee J, Armstrong DT, Ssengooba W, et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testingMycobacteriumtuberculosissusceptibility to first-and second-line drugs. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(1):11-18.

[8] Hall L, Jude KP, Clark SL, et al. Evaluation of the Sensititre MycoTB plate for susceptibility testing of theMycobacteriumtuberculosiscomplex against first- and second-line agents. J Clin Microbiol, 2012, 50(11):3732-3734.

[9] Woods GL, Brown-Elliott BA, Conville PS, et al. Susceptibi-lity testing of mycobacteria, nocardiae, and other aerobic actinomycetes; approbed standard-secone edition.Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2011.

[10] Campbell PJ, Morlock GP, Sikes RD, et al. Molecular detection of mutations associated with first- and second-line drug resistance compared with conventional drug susceptibility testing ofMycobacteriumtuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(5):2032-2041.

[11] Jagielski T, Ignatowska H, Bakua Z, et al. Screening for streptomycin resistance-conferring mutations inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from Poland. PLoS One, 2014, 9(6):e100078.

[12] Feuerriegel S, Cox HS, Zarkua N, et al. Sequence analyses of just four genes to detect extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisstrains in multidrug-resistant tuberculosis patients undergoing treatment. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(8):3353-3356.

(本文編輯：薛愛華)

Evaluation of the TREK Sensititre?MYCOTB for susceptibility testing of theMycobacteriumtuberculosisto first-line and second-line anti-tuberculosis drugs

ZHENGYang,XIAHui,ZHAOYan-lin.

NationalTuberculosisReferenceLaboratory,NationalCenterforTuberculosisControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

ZHAOYan-lin，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the performance of Sensititre?MYCOTB MIC plate to detecting the susceptibility ofMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis) to twelve first-line and second-line anti-tuberculosis (TB) drugs (MYCOTB, a dry microdilution plate containing 12 lyophilized antibiotics). Methods A total of 151 isolates were randomly selected from China National Tuberculosis Reference Laboratory. Drug susceptibility testing (DST) was conducted to 12 first-line and second-line anti-tuberculosis (TB) drugs, including ofloxacin (Ofx), mo-xifloxacin (Mfx), rifampin (RFP), amikacin (Am), streptomycin (Sm), rifabutin (Rfb), para-aminosalicylic acid (PAS), ethionamide (Eto), cycloserine (Cs), isoniazid (INH), kanamycin (Km), ethambutol (EMB). We used the Middlebrook 7H10 agar proportion method (APM) as the reference method to evaluate the sensitivity, specificity and feasibility of MYCOTB. The agreement between two methods was also evaluated. Results The sensitivity was ≥90% for 8/12 drugs (Ofx, Mfx, RFP, Sm, Rfb, Eto, Km and EMB), and was ≥80% for other three drugs except for Cs. The specificity was ≥90% for all drugs except for Rifabutin (86.8%). Categorical agreement between MYCOTB and APM was ≥94% for 9/12 drugs (Ofx, Mfx, RFP, Am, Sm, PAS, Eto, Cs and Km) and conditional agreement was ≥96% for 10/12 drugs (Ofx, Mfx, RFP, Am, Sm, PAS, Eto, Cs, Km and EMB). For MYCOTB, the median time to plate interpretation was 10 days and inter-reader agreement was ≥94% for 10/12 drugs (Ofx, Mfx, RFP, Am, Sm, Rfb, PAS, Eto and EMB). Conclusion MYCOTB can provide reliable results for susceptibility testing ofM.tuberculosisto first-line and second-line drugs.

Mycobacteriumtuberculosis； Drug resistance, bacterial； Microbial sensitivity tests； Antibio-tics, antitubercular

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.005

“十二五”國家科技重大專項(xiàng)(2014ZX10003002)

102206北京，中國疾病預(yù)防控制中心 國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2015-01-28)