李玲 麥明琴 曾玉坤 饒騰子 丁紅珂 劉玲

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 510010）

36例遺傳性耳聾的產(chǎn)前診斷分析

李玲 麥明琴 曾玉坤 饒騰子 丁紅珂 劉玲

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 510010）

目的通過超聲引導(dǎo)下介入性穿刺術(shù)獲取胎兒附屬物標(biāo)本進行遺傳性耳聾基因產(chǎn)前診斷，降低遺傳性耳聾患兒的出生率。方法孕11～14周孕婦采用超聲引導(dǎo)下絨毛活檢術(shù)抽取胎盤絨毛；孕16周后孕婦在超聲引導(dǎo)下抽取羊水；孕25周以上因有其他項目需同時產(chǎn)前診斷的，則在超聲引導(dǎo)下抽取臍血。應(yīng)用短串重復(fù)序列連鎖分析（STR）進行母血污染鑒別，遺傳性耳聾基因芯片檢測技術(shù)對GJB2、GJB3、SLC26A4和mtDNA12SrRNA 4個耳聾基因進行測序。結(jié)果36例產(chǎn)前介入性穿刺術(shù)均一次成功。36例標(biāo)本經(jīng)STR鑒定均排除母血污染。7例未檢測到明確耳聾基因突變；16例為耳聾基因雜合突變，3例為耳聾基因雜合突變伴多態(tài)性位點突變，已出生的，生后隨訪新生兒聽力篩查結(jié)果均正常；10例為耳聾基因雙重雜合突變，經(jīng)遺傳咨詢后，孕婦及家人選擇終止妊娠。結(jié)論超聲引導(dǎo)下行介入性穿刺術(shù)是進行遺傳性耳聾基因產(chǎn)前診斷獲取胎兒附屬物標(biāo)本的有效途徑。聯(lián)合耳聾基因芯片檢測技術(shù)及STR檢測，可排除母血污染，準(zhǔn)確診斷胎兒遺傳性耳聾基因型，有效降低遺傳性耳聾患兒的出生率。

遺傳性耳聾；介入性穿刺術(shù)；產(chǎn)前診斷

耳聾是人類最常見的致殘原因之一，嚴(yán)重影響著人類的生活質(zhì)量并帶來沉重的社會及家庭經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。據(jù)估算，我國每年約有2000萬的新生兒出生，而耳聾的發(fā)生率可達(dá)1‰，其中至少約60%～70%與遺傳因素有關(guān)［1，2］，即遺傳性耳聾。它包括綜合征性耳聾及非綜合征性耳聾，非綜合征性耳聾占遺傳性耳聾的70%，其中的77%為常染色體隱性遺傳。人類遺傳學(xué)研究的開展和基因芯片等遺傳學(xué)應(yīng)用技術(shù)的進步，極大地推進了臨床上遺傳性耳聾的基因診斷和遺傳咨詢。研究表明，在中國人群中，遺傳性耳聾的主要致病基因包括GJB2、GJB3、SLC26A4和mt DNA12Sr RNA，其遺傳方式為常染色體隱性遺傳［3，4］，通過熱點突變基因的篩查可以實現(xiàn)遺傳性耳聾的早防早治。對有明確遺傳學(xué)病因和遺傳風(fēng)險的耳聾家庭，選擇產(chǎn)前診斷技術(shù)可有效避免遺傳性耳聾兒的出生，切實降低出生缺陷。本院醫(yī)學(xué)遺傳中心在2011年3月至2014年2月期間，共為36個胎兒進行了適宜的產(chǎn)前診斷，現(xiàn)分析及總結(jié)如下。

1 資料與方法

1．1 研究對象 2011年3月至2014年2月32例在廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心行胎兒耳聾基因產(chǎn)前診斷的孕婦。22例孕婦曾生育過遺傳性耳聾患兒，先證者均已行耳聾基因確診，同時檢測出夫婦雙方均為耳聾基因攜帶者；14例孕婦為孕檢或婚檢時耳聾基因篩查為耳聾基因攜帶者，隨后配偶已診斷為耳聾基因攜帶者。

1．2 方法與儀器

1．2．1 超聲引導(dǎo)下介入性穿刺術(shù) 36例孕婦均行超聲檢查，排除無腦兒、嚴(yán)重胸腹壁裂、開放性脊柱裂、單心室等致死性畸形及明顯的胎兒結(jié)構(gòu)異常，并完善常規(guī)穿刺前檢查。手術(shù)時，在超聲定位下，選擇安全及適宜位置進針。6例孕11～14周胎兒，采用18G一次性PTCD針絨毛活檢術(shù)抽取胎盤絨毛10 mg；25例孕16～24＋6周胎兒，采用20G一次性PTCD針抽取羊水10 ml；5例孕25周以上胎兒，夫婦雙方均為耳聾基因攜帶者，同時因超聲提示胎兒異常需行產(chǎn)前診斷，采用22G一次性PTCD針抽取臍血3 ml。術(shù)后觀察胎心，孕婦術(shù)后在休息室休息半小時，無異常后離院。術(shù)后定期復(fù)診及隨訪。所有行產(chǎn)前診斷的孕婦均簽署介入性產(chǎn)前診斷及耳聾基因診斷知情同意書。

1．2．2 STR鑒別母血污染 采用QT PCR技術(shù)，ABI公司3500XLsystem，在測序儀上對母親及胎兒的26個STR位點（AMEI、DXS981、DYS448、D21S1412、D13S256、DXYS267等）進行測定，然后利用軟件自動分析等位基因的基因型。

1．2．3 基因檢測 采用廈門致善試劑盒提取絨毛、羊水、臍血DNA，測量DNA濃度計純度，DNA濃度為100～200 ng／μl，純度OD260／280在1．7～2．0之間。將DNA加入反應(yīng)體系中進行PCR擴增，擴增體系見表1，反應(yīng)條件見表2。按照8μl雜交緩沖液、4μl A體系PCR產(chǎn)物、4μl B體系PCR產(chǎn)物的比例配制雜交溶液。按照雜交盒、墊片、芯片、蓋片的順序裝配好雜交反應(yīng)盒。運行遺傳性耳聾基因檢測芯片雜交程序，雜交條件為50℃雜交1．5小時，速度為15 rpm。反應(yīng)結(jié)束后進行芯片洗滌。使用奧博基因芯片掃描儀進行芯片掃描，記錄判讀結(jié)果和芯片信息。

表1 基因擴增體體系表

表2 遺傳性耳聾基因檢測PCR擴增條件

2 結(jié) 果

2．1 36例行介入性產(chǎn)前診斷孕婦均無感染、流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)窘迫等并發(fā)癥。經(jīng)STR鑒別，36例全部排除母血污染。

2．2 36例遺傳性耳聾基因產(chǎn)前診斷結(jié)果中，7例未檢測到明確突變，隨訪新生兒聽力篩查結(jié)果未見異常。7例GJB2基因109雜合突變；7例GJB2基因235．del．c雜合突變；2例SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G雜合突變；1例SLC26A4基因IVS7-2A＞G，GJB2基因c．608．T＞C雜合；1例GJB2基因235．del．c雜合突變，GJB2 c．79G＞A，c．341A＞G；1例GJB2基因235．del．c雜合突變，79G＞A雜合（多態(tài)），22例隨訪新生兒聽力篩查結(jié)果均未見異常，4例未出生。10例雙重雜合突變：包括6例GJB2基因109 G＞A／235 del C雙重雜合突變，1例GJB2基因109 G＞A／c．250 G＞A雙重雜合突變，1例GJB2基因235 del C／c．176 del 16bp雙重雜合突變；1例SLC26A4基因c．1343 C＞T／c．2086 C＞T雙重雜合突變，均與先證者基因型一致；1例SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G／754 T＞C雙重雜合突變。10例隨訪結(jié)果孕婦均已選擇終止妊娠。

3 討 論

耳聾是影響我國出生人口素質(zhì)的重要問題之一，目前臨床上對遺傳性耳聾缺乏有效的治療手段。患兒往往需要使用輔助聽力器械協(xié)助，部分患兒因未能及時診治而影響生活與學(xué)習(xí)，并且可能對家庭造成較大經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此，遺傳性耳聾的產(chǎn)前診斷在耳聾出生缺陷的防治工作中具有重要意義。遺傳性耳聾產(chǎn)前診斷是應(yīng)用耳聾基因測序技術(shù)了解胎兒攜帶耳聾基因的情況，從而做出是否為遺傳性耳聾的診斷。目前研究發(fā)現(xiàn)我國人群遺傳性耳聾的最常見的致病基因為GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12Sr RNA，基因突變是中國人群中常見的致病原因，通過對熱點突變的篩查可以實現(xiàn)遺傳性耳聾的產(chǎn)前預(yù)防。我們通過超聲引導(dǎo)下在胎盤上抽取絨毛組織、羊膜腔穿刺抽取羊水、臍帶穿刺抽取臍血等微創(chuàng)性取樣方法，提取胎兒DNA進行耳聾基因測序，獲取胎兒耳聾基因的遺傳信息。為了排除行產(chǎn)前診斷過程中母體DNA的影響，結(jié)合運用STR位點分析方法以排除母血污染。

3．1 GJB2與遺傳性耳聾 GJB2是最常見的耳聾基因。GJB2編碼連接蛋白（connexin26），負(fù)責(zé)細(xì)胞間信號介導(dǎo)和離子傳遞，突變的GJB2可能導(dǎo)致產(chǎn)生不正常的連接蛋白，進而干擾細(xì)胞間隙連接的功能，引起內(nèi)耳鉀離子回收障礙而致聾。研究表明到目前為止已發(fā)現(xiàn)GJB2基因110余種突變方式，GJB2突變導(dǎo)致的遺傳性耳聾幾乎遍布?xì)W洲、美洲、亞洲等地，在不同人種間存在不同的GJB2基因突變及發(fā)生頻率［5］。在我們的研究中，未檢測到GJB2基因的純合性突變。而發(fā)現(xiàn)7例GJB2基因109 G＞A雜合突變，7例GJB2基因235．del．c雜合突變，1例GJB2基因235．del．c雜合突變合并GJB2 c．79G＞A、c．341A＞G突變，這7例孕婦均順利分娩，回訪結(jié)果顯示，嬰兒聽力測試正常。發(fā)現(xiàn)的6例 GJB2基因235 del C雜合突變伴109 G＞A雜合突變，1例GJB2基因109 G＞A雜合突變伴c．250 G＞A雜合突變，1例GJB2基因235 del C雜合突變伴c．176 del 16 bp雜合突變，因胎兒患耳聾風(fēng)險增加，回訪顯示孕婦均選擇終止妊娠。有研究顯示不僅致病突變的純合性突變可以致聾，而且不同的兩個致病突變形成復(fù)合雜合突變時也可致聾，臨床表現(xiàn)為中重度耳聾，雙耳多呈對稱性，前庭功能基本正常，但在少數(shù)病例也存在臨床表型的異質(zhì)性。Wilcox SA等［6］研究發(fā)現(xiàn)109G＞A純合和復(fù)合雜合突變和耳聾有關(guān)。陳幗玲等［7］在一項包括233名耳聾患者及83名患者直系親屬、100名聽力正常志愿者的研究發(fā)現(xiàn)，耳聾患者組中共發(fā)現(xiàn)4例109 G＞A雜合突變伴c．235 del C雜合突變，而家屬組和對照組中未發(fā)現(xiàn)此類型突變。250 G＞A突變是近年發(fā)現(xiàn)的一個致病位點，目前研究甚少，在國內(nèi)尚未見報道。Matos等［8］在一位葡萄牙女性耳聾患者的家系研究發(fā)現(xiàn)，-3438C-T和250G-A突變?yōu)閺?fù)合雜合子后會引起亮氨酸變成蛋氨酸，從而導(dǎo)致耳聾的出現(xiàn)。這些研究結(jié)果提示了會導(dǎo)致聽力障礙的復(fù)合突變，其突變位點之間可能存在內(nèi)部修飾效應(yīng)，也可能是由不同基因之間的相互影響造成。

3．2 SLC26A4（又稱PDS基因）與遺傳性耳聾SLC26A4基因編碼Pendrin蛋白，研究表明Pendrin功能與離子和蔗糖轉(zhuǎn)運有關(guān)［9，10］。有分析表明95%～97%的中國大前庭水管患者中至少可以發(fā)現(xiàn)一個SLC26A4基因突變，并且大多數(shù)患者可以發(fā)現(xiàn)純合或復(fù)合突變，顯示大前庭水管綜合征的發(fā)病原因是SLC26A4基因突變［11］。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)2例SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G雜合突變，1例SLC26A4基因IVS7-2A＞G／GJB2基因c．608．T＞C雜合，這3例孕婦均順利分娩，回訪結(jié)果顯示嬰兒聽力測試正常。1例SLC26A4基因c．1343 C＞T雜合／c．2086 C＞T雜合，與先證者基因型一致，1例SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G雜合突變／754 T＞C雜合突變，因胎兒患耳聾風(fēng)險增加，回訪顯示孕婦均選擇終止妊娠。754T＞C位點目前在國內(nèi)外報道較少，馮永等［12］在一項家系研究中發(fā)現(xiàn)患耳聾的先證者為1229C＞T、754T＞C的復(fù)合雜合突變，1229C＞T來自其表型正常的父親，754T＞C來自其表型正常的母親，與國外報道一致［13，14］。c．2086 C＞T（又稱Q696X）是第18號外顯子2086位點的胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?，?dǎo)致合成蛋白質(zhì)時696位上的谷氨酸改變?yōu)榻K止密碼，從而使蛋白的翻譯提前終止［15］。胡鵬等［16］在一項研究中發(fā)現(xiàn)該突變的先證者為2086 C＞T和IVS7-2A＞G復(fù)合雜合突變，表現(xiàn)為前庭水管擴大伴極重度聾，其父母基因型分別為2086 C＞T和IVS7-2A＞G的單雜合子，聽力正常。進一步對100例正常人DNA樣本18號外顯子進行PCR擴增并測序．未檢測出相同突變，故認(rèn)為c．2086 C＞T是一個新的致聾突變。沈姍姍等［17］對29個耳聾家系的42例耳聾患者及父母進行SLC26A4基因測序，結(jié)果顯示IVS7-2A＞G純合性突變患者為極重度感音神經(jīng)性耳聾，當(dāng)中有兩家系患者發(fā)生IVS7-2A＞G雜合性突變，其中一家系患者伴隨T410M雜合性突變表現(xiàn)為極重度感音神經(jīng)性耳聾，另一家系未伴隨其他突變，則聽力正常。袁永一等［18］在一項人群研究中對SLC26A4基因IVS7-2 A＞G突變相關(guān)的全序列分析，這項研究包括1552例聾啞學(xué)生和150例聽力正常的對照組群，研究中顯示1552例耳聾患者中IVS7-2A＞G純合突變及包含一個IVS7-2A＞G突變的復(fù)合雜合突變攜帶者共161例，占10．37%，正常對照人群IVS7-2 A＞G突變檢出率為2%，均為單雜合突變，且均未找到另一個突變位點。事實上，攜帶SLC26A4單等位基因突變的耳聾患者中有一定比例也表現(xiàn)為不同程度聽力障礙［19］，其原因在于另外的突變可能位于非外顯子區(qū)域，通過現(xiàn)有方法尚不能檢測出來。

在遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷的過程中，我們發(fā)現(xiàn)充分地告知與知情選擇尤為重要。大力進行遺傳性耳聾相關(guān)知識的宣教是開展耳聾基因篩查的前提，在廣大孕齡婦女及產(chǎn)檢孕婦當(dāng)中進行篩查是避免漏診的關(guān)鍵，對有指征的胎兒適時行產(chǎn)前診斷是降低患兒出生的重點。

遺傳性耳聾的產(chǎn)前診斷目前還有許多需改進的方面。首先，由于人類基因組的復(fù)雜性及耳聾基因的高度遺傳異質(zhì)性、檢測費用昂貴等原因，臨床上僅對常見致病基因進行檢測，其結(jié)論存在一定的局限性，對準(zhǔn)確診斷及預(yù)防帶來了一定的困難；其次，部分突變位點在不同人群研究中得出的結(jié)論并不一致，為產(chǎn)前診斷的指導(dǎo)帶來一定困惑，尤其是對相互影響的復(fù)合突變位點的風(fēng)險預(yù)測，更需要進一步深入的關(guān)聯(lián)研究及生物功能學(xué)研究，以進一步闡明其具體致病機制。隨著遺傳學(xué)和無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)的進步，我們相信遺傳性耳聾的產(chǎn)前診斷在降低我國出生缺陷率的工作中將發(fā)揮著重要的作用。

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ObjectivePrenatal diagnosis tests were performed under the guidance of ultrasound by chorionic villus sampling，amniocentesis and cordocentesis，all the fetal samplings were sent to detect the hereditary deafness genes in order to reduce the deafness birth defects．MethodChorionic villus sampling in gestation of 11～14 weeks，amniotic fluid by amniocentesis after 16 weeks in gestation，umbilical cord blood sampling after 25 weeks together with other prenatal diagnosis index．Sequencing the four hereditary deafness-related genes GJB2，GJB3，SLC26A4 and mtDNA12Sr RNA，all the samples were excluded the maternal blood contamination by short tandem repeat test（STR）．ResultsIn 36 cases，no definite deafness-related gene mutation in 7 cases，16 cases were found heterozygous，heterozygous with polymorphism were found in 3 cases，and double heterozygous in 10 cases．ConclusionsPrenatal diagnosis procedure under ultrasonic guidance is a safe and effective way in hereditary deafness detection．Combining with the technique of deafness-related gene sequencing and STR，fetus with double heterozygous were diagnosed，then genetic consulting were offered to the parents to considering the baby’s outcome．In that way，the birth rate of hereditary deafness can be reduced．

hereditary deafness；interventional procedure；prenatal diagnosis

R714．53

A

2014-10-19）編輯：宋文穎

10．13470／j．cnki．cjpd．2015．01．011