李?！∪f(wàn)科　叢銘等

摘要：采用溫室盆栽試驗(yàn)測(cè)試5株芽孢桿菌屬生防細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病的拮抗作用。結(jié)果表明，拮抗細(xì)菌芽孢桿菌1205對(duì)苗期煙草黑脛病有較穩(wěn)定的防治效果，其分泌物還有促進(jìn)煙株生長(zhǎng)的作用，經(jīng)鑒定1205菌株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

關(guān)鍵詞：拮抗細(xì)菌；煙草黑脛??；盆栽試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1094-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.016

Abstract：5 Bacillus strains with strong antagonism were selected with a pot experiment simulating to control Phytophthora parasitica var. nicotianae at stage of seedling. The control effects of strain 1205 were relatively high. Secrete of strain 1205 accelerated the growth of tobacco. 1205 was identified as Bacillus cereus.

Key words： antagonistic bacterium；Phytophthora parasitica var. nicotianae； pot experiment

煙草黑脛病[Phytophthora parasitica var. nicotianae（Breda de Hean）Tuker]俗稱爛腰病、黑根病，是一種常見(jiàn)的土傳真菌病害。煙草黑脛病在苗床及大田中均可發(fā)生，尤其是在高溫高濕、多雨年份及低洼地區(qū)，該病發(fā)展蔓延快，在1～2周內(nèi)可造成整塊煙田毀滅，導(dǎo)致絕收[1，2]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和相關(guān)研究的深入，生物防治成為煙草黑脛病的研究重點(diǎn)，特別是在利用有益微生物進(jìn)行病害防治等方面[3-7]。本研究對(duì)篩選出來(lái)的5株生防細(xì)菌進(jìn)行盆栽防效試驗(yàn)，以研究其對(duì)煙草黑脛病的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草黑脛病菌病原菌煙草疫霉（Phytophthora parasitica Gzufp-9）由貴州大學(xué)生命科學(xué)院真菌資源研究室提供。拮抗細(xì)菌為芽孢桿菌1107、7403、1205、1601、5801菌株。煙草品種為畢納1號(hào)。

1.2 盆栽試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草育苗 采用漂浮育苗法，育苗前將浮盤(pán)和盛水方盤(pán)進(jìn)行消毒，檢查盤(pán)孔是否堵塞，用松散基質(zhì)填滿孔穴，用手指輕微下壓至有實(shí)落感，約下壓1 cm，然后裝滿刮平露出盤(pán)面孔格，每孔播種畢納1號(hào)種子2～3粒，播種后不再蓋基質(zhì)，立即放入盛有適量水的方盤(pán)內(nèi)。待出苗具備2片真葉時(shí)即可進(jìn)行間苗，確保每孔內(nèi)有1株均勻一致的煙苗。在煙苗已具有4葉1心，苗高3～4 cm時(shí)剪葉，剪去超過(guò)盤(pán)孔的根系控制大苗生長(zhǎng)，促使小苗生長(zhǎng)。后期剪葉兩次，促進(jìn)莖部的生長(zhǎng)，達(dá)到煉苗的目的[8]。移栽，每盆1株，10 d后進(jìn)行處理。

1.2.2 煙草疫霉孢子懸浮液的制備 利用已分離出的煙草疫霉菌菌株Gzufp-9，參照煙草疫霉孢子懸浮液制備方法[9]制備煙草疫霉孢子懸浮液，孢子濃度為104個(gè)/mL。

1.2.3 拮抗細(xì)菌接種物的制備 在NA平板上將分離得到的拮抗菌株1107、7403、1205、1601和5801活化，取兩環(huán)活化的培養(yǎng)物分別接入盛有100 mL NA培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，28 ℃、160 r/min培養(yǎng)3 d，得到拮抗菌株懸浮液。

1.2.4 接種方法 病原菌接種采用王麗珍[10]的方法，將煙草疫霉孢子懸浮液灌根接種于煙株根部土壤中。拮抗細(xì)菌采用灌根接種法，將已經(jīng)制備好的濃度為1×108個(gè)/mL拮抗菌發(fā)酵液灌根，接種于煙株根部土壤中。選擇長(zhǎng)勢(shì)大小相近，苗齡40 d的煙苗，移栽到盆內(nèi)，每盆1株，移栽10 d后接種，試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理15株，設(shè)3次重復(fù)。①處理組1：在煙株移栽10 d后，首先接種拮抗菌發(fā)酵液10 mL，10 d后再接種煙草黒脛病病原菌游動(dòng)孢子懸浮液（104個(gè)/mL）10 mL；②處理組2：在煙株移栽10 d后同時(shí)接種煙草黒脛病病原菌游動(dòng)孢子懸浮液（104個(gè)/mL）10 mL和拮抗菌發(fā)酵液10 mL；③處理組3：在煙株移栽10 d后，首先接種煙草黒脛病病原菌游動(dòng)孢子懸浮液（104個(gè)/mL）10 mL，10 d后再接種拮抗菌發(fā)酵液10 mL；④發(fā)病對(duì)照組：在煙株移栽10 d后只接種煙草黒脛病病原菌游動(dòng)孢子懸浮液（104個(gè)/mL）20 mL，不接種拮抗菌；⑤拮抗菌對(duì)照組：在煙株移栽10 d后接種拮抗菌發(fā)酵液20 mL，不接種病原菌；⑥空白對(duì)照組：在煙株移栽10 d后接種清水20 mL。

1.3 小區(qū)試驗(yàn)

在貴州省畢節(jié)市黔西縣進(jìn)行田間試驗(yàn)，所有試驗(yàn)小區(qū)的栽培條件均勻一致，試驗(yàn)期間管理按照常規(guī)進(jìn)行，拮抗菌田間藥效試驗(yàn)小區(qū)按隨機(jī)排列的方式進(jìn)行。

1.3.1 施藥方法 在煙株移栽前采用拮抗菌發(fā)酵液噴灑方式施用到土壤中，移栽后拮抗菌以灌根的方式接種到煙株根部。選用生產(chǎn)中常用的器械，菌種發(fā)酵采用泰斯特6000Ⅱ型培養(yǎng)箱，記錄所用器械的類型和操作條件的全部資料。菌種的施用應(yīng)保證接種量準(zhǔn)確，分布均勻。接種量偏差超過(guò)±10%的要記錄。第一次接種在煙株移栽前10 d，煙株移栽后每隔10 d接種1次，共接種3次，記錄每次接種的日期和作物生育期。分別配置菌懸液濃度為102、103、104、105、106、107、108、109個(gè)/mL的1205菌株制劑，每株接種20 mL。設(shè)陽(yáng)性藥對(duì)照處理，在煙株移栽前10 d接種58%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑（800×）噴淋莖基部。每處理設(shè)4次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)面積為15 m2，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)間筑埂隔離，以防藥液串流。

1.3.2 調(diào)查、記錄和測(cè)量方法 接種前調(diào)查1次，分別在施藥后7、14、21 d各調(diào)查1次。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T39-1996規(guī)定執(zhí)行。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)，全株無(wú)病；1級(jí)，莖部病斑不超過(guò)莖圍的1/2或1/2以下，葉輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；2級(jí)，莖部病斑超過(guò)莖圍的1/2或1/2以上葉片凋萎；3級(jí)，莖部病斑環(huán)繞莖圍或2/3以上葉片凋萎；4級(jí)，病株全葉凋萎或枯死。目測(cè)法調(diào)查記錄拮抗菌對(duì)目標(biāo)病原菌的拮抗效果，同時(shí)記錄對(duì)作物有益的影響（如加速成熟、增加活力等）。藥效按公式（1）和（2）計(jì)算。

式中，對(duì)照病指為空白對(duì)照區(qū)接菌后的病情指數(shù)；處理病指為拮抗試驗(yàn)區(qū)接種拮抗菌后的病情指數(shù)。

1.3.3 拮抗細(xì)菌對(duì)煙株生長(zhǎng)的影響 以煙株生長(zhǎng)后期為觀測(cè)樣本，每處理隨機(jī)選擇25株，分別測(cè)量其株高、節(jié)距、莖圍、葉長(zhǎng)、葉寬、有效葉片數(shù)等指標(biāo)。對(duì)各處理的促生效果采用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)SPSS17.0進(jìn)行K-S檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌盆栽防效的篩選

通過(guò)盆栽試驗(yàn)，接種5 d后，分別對(duì)各個(gè)處理進(jìn)行調(diào)查?？瞻讓?duì)照、拮抗菌對(duì)照和處理組2均未發(fā)病，而發(fā)病對(duì)照、處理組1和處理組3中的煙株已陸續(xù)發(fā)病，處理組3中的有些煙株發(fā)病級(jí)數(shù)也從1級(jí)達(dá)到了4級(jí)。

煙苗移栽40 d時(shí)，拮抗菌對(duì)照長(zhǎng)勢(shì)良好（表1）；處理組1中發(fā)病指數(shù)都相對(duì)較低，各菌株的防效都達(dá)到了65.00%以上，尤其1205菌株相對(duì)防效達(dá)到了80.44%；處理組2中1601、7403、5801菌株處理的煙株發(fā)病指數(shù)相對(duì)較高，而經(jīng)1107和1205菌株處理的煙苗生長(zhǎng)良好，尤其1205菌株相對(duì)防效達(dá)到了84.79%；處理組3中發(fā)病指數(shù)相對(duì)較高，1601、5801、7403菌株處理的煙株相對(duì)防效在30.00%以下，只有1205菌株的相對(duì)防效達(dá)到了78.23%。由此可見(jiàn)，1205菌株對(duì)病原菌不僅有預(yù)防效果，還有較好的治療和鈍化作用。因此，選取1205菌株進(jìn)行濃度篩選試驗(yàn)。

2.2 1205菌株的小區(qū)試驗(yàn)

為了更充分地說(shuō)明1205菌株對(duì)煙草黑脛病的防效及掌握菌株的施用量，以58%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑為陽(yáng)性對(duì)照藥，將1205菌株設(shè)計(jì)了8個(gè)菌懸液濃度梯度，采用隨機(jī)區(qū)組排列方法，進(jìn)行了藥篩試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。防治效果隨著菌懸液濃度的增加而增加，當(dāng)菌懸液濃度達(dá)到105個(gè)/mL時(shí)，相對(duì)防效就達(dá)到了54.1%，優(yōu)于化學(xué)藥劑甲霜靈·錳鋅的防效（50.6%），當(dāng)菌懸液濃度達(dá)到109個(gè)/mL時(shí)，田間相對(duì)防效達(dá)到了75.9%?？梢?jiàn)1205菌株對(duì)于煙草黑脛病的防治效果是穩(wěn)定的。

2.3 1205菌株對(duì)煙草植株生長(zhǎng)的影響

小區(qū)試驗(yàn)中觀察1205菌株不同菌懸液濃度對(duì)煙草植株的生長(zhǎng)情況（表3）表明，與對(duì)照相比，不同濃度的菌懸液對(duì)煙草植株的生長(zhǎng)均有不同程度的影響，其中當(dāng)1205菌株菌懸液濃度達(dá)到109個(gè)/mL時(shí)，表現(xiàn)尤為突出，與對(duì)照藥58%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑相比，株高、莖圍、葉長(zhǎng)、葉寬、有效葉片數(shù)分別增長(zhǎng)了13%、15%、3%、33%、10%；而與對(duì)照相比，株高、莖圍、葉長(zhǎng)、葉寬、有效葉片數(shù)分別增長(zhǎng)了13%、16%、19%、40%、10%。由此可見(jiàn)，1205菌株的分泌物還具有促進(jìn)煙株生長(zhǎng)的作用。

2.4 1205菌株的種類鑒定

將1205菌株接種在普通瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)36 h，菌落近圓形，灰白色，不透明，菌落大，直徑達(dá)3～7 mm，邊緣不整齊呈擴(kuò)展?fàn)睿砻娲植陬w粒狀似毛玻璃狀或蠟狀，不分泌色素，為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，桿狀，1.0～1.3 μm×3.0～5.0 μm，成鏈，具有運(yùn)動(dòng)性，芽孢橢圓形，端生或次端生，芽孢膨大不明顯，能耐受7%NaCl，接觸酶陽(yáng)性、葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性、淀粉水解陽(yáng)性、硝酸鹽還原陽(yáng)性、明膠液化陽(yáng)性、麥芽糖發(fā)酵陽(yáng)性、半固體穿刺試驗(yàn)陽(yáng)性、酪素水解陽(yáng)性、VP試驗(yàn)陰性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性、吲哚試驗(yàn)陰性、蔗糖發(fā)酵陰性、乳糖發(fā)酵陰性、甘露醇水解陰性。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《芽孢桿菌屬》，初步鑒定為芽孢桿菌屬。將1205菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，160 r/min、28 ℃培養(yǎng)12 h，離心收集菌體。采用上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)的柱式基因組DNA抽提試劑盒（細(xì)菌）提取基因組DNA。以提取到的DNA為模板，用正向引物16SF（5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物16SR（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）對(duì)菌株的16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，54 ℃ 30 s，72℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃停止。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，長(zhǎng)度為1 468 bp。測(cè)序結(jié)果在GenBank中與Bacillus cereus相似性為97%。綜合菌落形態(tài)、生理生化及分子鑒定，將1205菌株鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

4 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)在對(duì)篩選出來(lái)的1107、7403、1205、1601、5801 5株生防細(xì)菌進(jìn)行盆栽防效試驗(yàn)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)1205菌株對(duì)煙草黑脛病具有較穩(wěn)定的防治效果，防治效果隨著菌懸液濃度的增加而增加。且1205菌株的分泌物還具有促進(jìn)煙株生長(zhǎng)的作用。經(jīng)鑒定1205菌株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。對(duì)于1205菌株抑制煙草黑脛病的生理機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究。

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