李曉娟，白云峰，王睿林，鄔順全，侯 俊，李瑞生

（1.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039；2.解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病診療與研究中心，北京 100039）

扶正化積方劑對(duì)H22肝癌小鼠抑瘤的作用

李曉娟1，白云峰2，王睿林2，鄔順全1，侯 俊1，李瑞生1

（1.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039；2.解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病診療與研究中心，北京 100039）

目的研究扶正化積方（FZHJF）對(duì)小鼠H22肝癌移植瘤的抑制作用及對(duì)免疫功能的影響。方法建立小鼠皮下H22移植性肝癌模型，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、FZHJF低、中、高劑量組（4.55、13.65、40.95g/kg）和5-氟尿嘧啶組（0.2mL/10g），連續(xù)給藥12d后，采集腫瘤與臟器稱重并計(jì)算抑瘤率、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)；同時(shí)對(duì)各組腫瘤外觀和腫瘤病理進(jìn)行分析。結(jié)果腫瘤病理結(jié)果顯示均為典型的肝細(xì)胞癌。FZHJF劑量組的瘤重顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.05），F(xiàn)ZHJF的抑瘤率隨劑量升高而增加，高劑量組的抑瘤率（49.02％）接近5-FU組（51.51％）；腫瘤外觀圖顯示FZHJF從低劑量至高劑量組的腫瘤體積呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)，且均小于模型對(duì)照組。FZHJF各劑量組的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)均顯著高于模型對(duì)照組與5-FU組（P＜0.05）。結(jié)論FZHJF對(duì)H22肝癌移植瘤具有顯著的抑制作用和免疫增強(qiáng)作用，為今后臨床研究提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

FZHJF；移植性肝腫瘤；抑瘤率；免疫功能

目前臨床上的原發(fā)性肝癌死亡率較高，位居各種惡性腫瘤的第三位［1］。由于其起病隱匿，發(fā)展迅速，預(yù)后差，因而對(duì)肝癌的防治研究以及降低其發(fā)病率和死亡率仍是目前面臨的一個(gè)重要課題［2-3］。迄今為止，肝癌仍以手術(shù)治療為首選，但部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期而不能手術(shù)，或手術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移造成預(yù)后不良，因此迫切需要探索尋找療效更好的治療藥物和其他方法［4］。我國(guó)是中醫(yī)藥大國(guó)，中醫(yī)藥在抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高患者生存質(zhì)量和延長(zhǎng)患者生命等方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，已逐漸成為各種疾病研究的熱點(diǎn)［5］。FZHJF（抗癌方）經(jīng)臨床觀察，對(duì)肝癌有明顯的抑制作用并能改善患者生存質(zhì)量和延長(zhǎng)其生命。為探討該方藥的抗癌作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠H22肝癌移植瘤模型，觀察FZHJF對(duì)小鼠H22肝癌移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用及其對(duì)免疫功能的影響，以期為該方劑的藥理機(jī)制研究和臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株細(xì)胞

選擇SPF級(jí)昆明小鼠45只，雄性，20～22g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證【SCXK（軍）2012-0004】。本實(shí)驗(yàn)室具有SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證【SYXK（軍）2012-0010】。H22肝癌細(xì)胞株來(lái)源于解放軍302醫(yī)院藥學(xué)部實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

注射用5-氟尿嘧啶（5-FU，0.25g/10mL）購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)FA131122；生理鹽水由解放軍第302醫(yī)院制劑室提供（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：130527405）；抗癌方劑FZHJF顆粒是由黨參、炙黃芪、焦白術(shù)、茯苓、白芍、地龍肉、玄參、草河車、半枝蓮、紅花、生牡蠣、干姜、天花粉、夏枯草、當(dāng)歸、丹皮、雞內(nèi)金、山甲珠、炙甘草、白花蛇舌草配伍組成，由302醫(yī)院藥劑室配置，15g/袋。

1.3 模型制備及分組

將制備好的H22細(xì)胞懸液（癌細(xì)胞數(shù)調(diào)至1×108/mL）注射于小鼠右側(cè)腋窩下（0.2mL/只）［4］。接種24h后將小鼠隨機(jī)分為5組（9只/組）：模型對(duì)照組，F(xiàn)ZHJF顆粒低、中、高劑量（4.55、13.65、40.95g/kg）組、5-FU組。FZHJF的劑量根據(jù)人臨床劑量換算，換算公式：小鼠劑量（g/kg）=9.1×人臨床劑量（0.5g/kg）。此劑量作為低劑量，中劑量與高劑量分別為低劑量的3倍和9倍。FZHJF各劑量組的灌胃容量為0.55mL/20g小鼠體重，模型對(duì)照組灌胃等容積的生理鹽水，5-FU組腹腔注射（0.2mL/10g），1次/d，連續(xù)12d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

末次給藥后次日稱體重，處死小鼠剖取腫瘤稱重。根據(jù)公式計(jì)算抑瘤率=［1-（實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重）］×100％；同時(shí)采集各組小鼠的肝臟、胸腺和脾臟分別稱重，計(jì)算各組小鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)［6］。將各組剝離的腫瘤組織置入10％甲醛固定，HE染色觀察［4］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析并進(jìn)行組間兩兩比較分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)各組H22荷瘤小鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量和腫瘤的影響

實(shí)驗(yàn)前小鼠活動(dòng)、飲食、毛色均無(wú)異常。實(shí)驗(yàn)第5天各組小鼠腋下均可觸及腫瘤，5-FU組小鼠毛色較暗，易激惹。給藥前各組小鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與模型對(duì)照組比較，5-FU組的體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；而FZHJF中、高劑量組的體質(zhì)量顯著高于5-FU組（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)ZHJF中、高劑量組和5-Fu組的瘤重顯著減輕（P＜0.05）；而FZHJF低劑量組的瘤重顯著高于5-FU組與高劑量組（P＜0.05）。FZHJF的抑瘤率隨劑量升高而增加，高劑量組抑瘤率接近于5-FU組（表1）。

表1 FZHJF對(duì)H22荷瘤小鼠體質(zhì)量、瘤重及抑瘤率的影響Tab.1 Effect of FZHJF on body weight，the tumor weight and inhibition rate of H22-bearing mice

2.2 藥物對(duì)各組H22荷瘤小鼠腫瘤大小作用的對(duì)比分析

各組荷瘤小鼠的腫瘤病理結(jié)果均證實(shí)為典型的肝細(xì)胞癌。各組小鼠的腫瘤外觀圖對(duì)比顯示：模型對(duì)照組腫瘤較大，F(xiàn)ZHJF從低劑量至高劑量組的腫瘤體積呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)，且高劑量組腫瘤的大小與5-FU組腫瘤大小相仿（圖1）。

2.3 藥物對(duì)各組H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各劑量組肝臟指數(shù)之間均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。而FZHJF各劑量組的胸腺和脾臟指數(shù)均顯著高于模型對(duì)照組和5-FU組（P＜0.05）（表2）。

圖1 各組小鼠移植腫瘤外觀比較（標(biāo)尺=1cm）Fig.1 The appearance of liver tumors in each group（Bar=1cm）

表2 FZHJF對(duì)H22荷瘤小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Tab.2 Effect of FZHJF on liver index，spleen and thymus index of H22-bearing mice

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，原發(fā)性肝癌屬正氣不足，濕熱、痰濁、瘀血、氣滯等積聚所成。因此，采用扶正培本、活血化瘀、清熱解毒是中醫(yī)治療肝臟腫瘤的基本原則，而扶正抑瘤法是較高層次的治療大法，同時(shí)需要結(jié)合不同的治療方法靈活應(yīng)用［7］。邢風(fēng)舉［8］等報(bào)道周仲瑛教授以味少量輕的扶正藥物為基礎(chǔ)，味多量大的具有不同治療作用的抗腫瘤藥物為主導(dǎo)，佐以數(shù)味治療兼癥或新癥的藥物配伍治療肝癌，效果甚佳；何仁強(qiáng)［9］等應(yīng)用扶正化毒消癌方用于中晚期肝癌患者能改善肝功能、提高生存質(zhì)量并延長(zhǎng)生存期；苑靜波等［10］以扶正健脾中藥聯(lián)合經(jīng)肝動(dòng)脈插管灌注化療及栓塞治療肝癌，效果良好。上述研究均在使用“扶正”中藥的基礎(chǔ)上，加入不同功能的抗腫瘤中藥用于臨床肝癌的治療。而本方也同樣以扶正培本類中藥為基礎(chǔ)，加入活血化瘀類和清熱解毒類中藥（紅花、茯苓、半枝蓮等），同時(shí)配伍軟堅(jiān)散結(jié)類藥物（牡蠣、夏枯草）以及治療兼癥藥物（白芍、地龍肉、玄參等），經(jīng)長(zhǎng)期臨床觀察效果佳。然而目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)此方治療原發(fā)性肝癌的基礎(chǔ)性研究鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立肝癌H22移植瘤小鼠模型，觀察FZHJF（抗癌方）對(duì)肝癌移植腫瘤的抑制作用。腫瘤病理結(jié)果顯示均為典型的肝細(xì)胞癌，說(shuō)明H22移植瘤模型成功。中藥治療結(jié)果顯示，F(xiàn)ZHJF劑量組的瘤重顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.05），F(xiàn)ZHJF的抑瘤率隨劑量升高而增加，高劑量組的抑瘤率（49.02％）接近5-FU組（51.51％）。同時(shí)腫瘤外觀圖更加直觀地示FZHJF從低劑量至高劑量組的腫瘤體積呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)。上述結(jié)果均說(shuō)明此方對(duì)肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。眾所周知，抗腫瘤治療必須依靠機(jī)體自身免疫功能的增強(qiáng)或者恢復(fù)，而胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的大小可直接反映機(jī)體免疫水平的高低［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組和5-FU組的荷瘤小鼠有脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低的現(xiàn)象，說(shuō)明腫瘤以及化療藥物能導(dǎo)致機(jī)體的免疫水平下降。而FZHJF各劑量組均能夠使荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明FZHJF可促進(jìn)胸腺和脾臟細(xì)胞的增殖分化，具有一定的免疫增強(qiáng)作用從而增強(qiáng)其抑制腫瘤的效果，此結(jié)果與部分中藥具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能作用結(jié)果相一致［12］。但此方中各味中藥各自發(fā)揮的抑癌作用需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，F(xiàn)ZHJF對(duì)H22肝癌移植瘤具有顯著的抑制作用，其抑瘤作用與5-FU相近似，同時(shí)還可增強(qiáng)機(jī)體胸腺和脾臟細(xì)胞的增殖分化，具有免疫增強(qiáng)作用，為FZHJF（抗癌方）的臨床實(shí)踐提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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Experimental study of Fuzheng Huaji decoction inhibition effect on H22 tumor bearing mice

LI Xiao-juan1，BAI Yun-feng2，WANG Rui-lin2，WU Shun-quan1，HOU Jun1，LI Rui-sheng1
（1.Experimental Research Support Center，Beijing 100039，China；2.Liver Disease Center for Combined TCM and Western Medicine，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China）

ObjectiveTo study the anti-tumor and immune effects of FZHJF on H22 liver cancer-bearing mice.MethodsThe H22 transplanted mouse models were established and randomly divided into five groups：model group，low-，medium-and high-dose FZHJF（4.55，13.65，40.95g/kg）and 5-Fu groups（0.2mL/10g）.12 days after treatment，the tumor inhibitory rate，liver index，thymus index，spleen index were calculated.At the same time，the appearance of liver tumor and tumor pathology in different groups was analyzed.ResultsPathology results confirmed the tumors were hepatocelluar carcinoma.Tumor weight in FZHJF groups were lower than those of the model group（P＜0.05）；the tumor inhibitory rate increased with the dosage，and the tumor inhibitory rate in high dose group（49.02％）closed to 5-Fu group（51.51％）；the results of tumor appearance showed that the tumor volume have the trend of reduce gradually，and is smaller than the control group.Thymus index and spleen index in FZHJF groups were markedly higher than those of the model and5-FU groups（P＜0.05）.ConclusionFZHJF has significant anti-tumor effect on transplanted H22 tumor in mice and has the function of immunological enhancement，and these results will provide theoretical foundation for clinical practice of FZHJF.

FZHJF；Transplanted liver cancer；The tumor inhibitory rate；Immune function

R-332

A

1671-7856（2015）11-0042-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2015.11.010

解放軍第302醫(yī)院院長(zhǎng)創(chuàng)新基金（YNKT2013026）。

李曉娟（1980-），女，碩士，E-mail：sxlily55@163.com；白云峰（1970-），男，博士；李曉娟和白云峰為并列第一作者。

李瑞生（1969-），男，博士，副研究員，主要從事人類疾病動(dòng)物模型研究，E-mail：lrsheng@sohu.com；侯?。?973-），女，博士，副主任技師，E-mail：houjun5757@sina.com。

﹞2015-10-10