馬劍波孫愷馬沖曹壘趙建平陳陸馗

·基礎(chǔ)研究·

小分子干擾RNA沉默GLI1基因抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖

馬劍波1孫愷2馬沖3曹壘3趙建平3陳陸馗4

目的 通過(guò)研究小分干擾RNA(siRNA)沉默膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(GLI1)后對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖的影響。 方法 通過(guò)合成并轉(zhuǎn)染siRNA抑制U87細(xì)胞內(nèi)GLI1的表達(dá)，并記為GLI1 siRNA組，轉(zhuǎn)染無(wú)意義的siRNA和未轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞作為對(duì)照組。采用MTT法分析各組U87細(xì)胞的增殖，采用流式細(xì)胞技術(shù)分析各組細(xì)胞周期變化。 結(jié)果 Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組U87細(xì)胞內(nèi)GLI1的表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)；MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，U87細(xì)胞的活性與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比顯著下降，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的活性下降程度越明顯(P＜0.05)；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組U87細(xì)胞的細(xì)胞周期被阻滯于G1期，并且其S期細(xì)胞的數(shù)量明顯下降(P＜0.05)。 結(jié)論 抑制GLI1的表達(dá)可有效抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，提示GLI1可作為膠質(zhì)瘤的一種潛在治療靶點(diǎn)。

膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1； siRNA； 膠質(zhì)瘤

膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(glioma associated oncogene 1，GLI1)是GLI家族中參與Sonic hedgehog(Shh)信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)錄因子。HH/Gli1(Hedgehog/Gli1)信號(hào)通路是參與人類(lèi)胚胎期形成發(fā)育的經(jīng)典信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育期甚至發(fā)育期后的細(xì)胞生長(zhǎng)及分化過(guò)程中扮演了至關(guān)重要的角色。GLI1是Hedgehog/ Gli1細(xì)胞通路中主要的下游轉(zhuǎn)錄因子之一，其表達(dá)的GLI1蛋白也受該通路的調(diào)節(jié)。GLI1的表達(dá)可作為Hedgehog/Gli1細(xì)胞通路激活的典型標(biāo)志[1-3]。研究表明，Hedgehog/Gli1通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，存活和分化等生物學(xué)過(guò)程，其中GLI1被證實(shí)與許多惡性腫瘤密切相關(guān)。然而，對(duì)于GLI1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮的作用，目前尚不清楚。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)合成針對(duì)于GLI1的小分子干擾RNA(siRNA)，觀(guān)察其抑制GLI1的表達(dá)后對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，從而為膠質(zhì)瘤的治療提供新的選擇方向。

材料與方法

一、材料

U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)上海生命科學(xué)院生物細(xì)胞研究所；抗GLI1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：U87細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的培養(yǎng)基中，并置于含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.設(shè)計(jì)并合成siRNA：根據(jù)GLI1基因的cDNA序列，本實(shí)驗(yàn)采用與國(guó)際siRNA設(shè)計(jì)原則相符的全基因組分析和序列同源性分析兩種方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，目標(biāo)siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供，目標(biāo)序列為5′-GGACCACCGCATCTCTACA-3′。

3.siRNA轉(zhuǎn)染：利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，我們將U87細(xì)胞接種于6孔板中，siRNA GLI1組和異陰性對(duì)照組的siRNA最終濃度為100 nmol/L。培養(yǎng)72 h后，觀(guān)察并測(cè)定RNA干擾情況，并進(jìn)行下一步細(xì)胞學(xué)分析。

4.細(xì)胞生長(zhǎng)分析：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至104/mL并接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)6個(gè)復(fù)孔(空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組)，分別于轉(zhuǎn)染后12、24、48、72 h每孔加人5 μl MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄上清，加二甲基亞砜150 μl，室溫靜置15 min，振蕩10 min至紫色結(jié)晶完全溶解，置酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度值。試驗(yàn)重復(fù)3次，繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。

5.Western blotting分析GLI1蛋白的表達(dá)：將U87細(xì)胞加入至150 ml細(xì)胞裂解液中，于冰上孵育30 min，隨后在4℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液。蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，4℃封閉過(guò)夜。TBST洗膜30 min后加入一抗(Gli1∶1 000，GAPDH 1∶1 000)，室溫下孵育2 h；TBST洗膜30 min，加入二抗(1∶6 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜30 min，加入ECM試劑，暗室曝光，顯影，定影，并拍照。

6.流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期：用0.9 ml磷酸鹽緩沖液懸浮細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用70%乙醇固定細(xì)胞并置于4℃過(guò)夜。離心棄乙醇，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次。加碘化丙啶染色液30 μl，于4℃下避光作用15 min。采用Cell Quest Pro軟件觀(guān)察G0期、G1期、S期各期細(xì)胞所占的百分比。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不同時(shí)間點(diǎn)陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.siRNA GLI1的抑制效應(yīng)：以GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)組U87細(xì)胞內(nèi)GLI1的表達(dá)量顯著下降，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組GLI1表達(dá)量幾乎沒(méi)有發(fā)生變化(圖1)。這提示小分子干擾RNA沉默GLI1(si-GLI1)可有效地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)GLI1蛋白的表達(dá)。

圖1 Western blotting分析GLI1蛋白的表達(dá)

2.si-GLI1對(duì)細(xì)胞增殖的影響：通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的活性顯著下降，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的活性下降程度越來(lái)越明顯(P< 0.05)(圖2)。

圖2 MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA-GLI1后不同時(shí)間段各組U87細(xì)胞增殖的相對(duì)存活率(%)

3.si-GLI1對(duì)細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)表明，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞周期被阻滯于G1期，同時(shí)S期細(xì)胞的數(shù)量明顯下降(P<0.05)(圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組U87細(xì)胞的細(xì)胞周期

討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，惡性膠質(zhì)瘤患者的5年生存率低于5%[4]。盡管通過(guò)手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后化療治療惡性膠質(zhì)瘤已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但其實(shí)際治療效果卻不盡人意。因此，詳細(xì)闡明膠質(zhì)瘤的病理機(jī)制成為人們找到治愈惡性膠質(zhì)瘤的途徑的關(guān)鍵要素。

RNA干擾技術(shù)(RNAi)最為一種新型的基因沉默技術(shù)手段，可以有效地抑制特定目的基因的表達(dá)，并具有其他傳統(tǒng)技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)越性，通過(guò)少量雙鏈RNA分子介導(dǎo)的逐步放大的RNA干擾過(guò)程，從而簡(jiǎn)單、迅速地封閉目的基因[5]。目前，利用siRNA干擾技術(shù)干擾Gli-1蛋白表達(dá)，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，可以控制前列腺癌細(xì)胞增生，促使癌細(xì)胞凋亡[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用該技術(shù)，成功的抑制了U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

Shh信號(hào)通路高度保守，并且參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的重要環(huán)節(jié)。Shh通路的異常激活對(duì)致癌基因的產(chǎn)生具有重要作用。同時(shí)，Shh信號(hào)通路也是參與人類(lèi)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵通路[7-9]。Shh信號(hào)通路主要由Hh配體，受體Ptch、Smo，蛋白激酶A，以及下游的轉(zhuǎn)錄因子GLI1組成。正常情況下，PTCH 與SMO結(jié)合，抑制了轉(zhuǎn)錄因子GLI1對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄；在有Hh配體時(shí)，HH與PTCH結(jié)合，解除對(duì)SMO的抑制，進(jìn)而解除了對(duì)GLI1的抑制，最終啟動(dòng)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄[10-11]。研究表明，Hh信號(hào)通路的異常激活可誘發(fā)許多腫瘤疾病的發(fā)生與發(fā)展[12-15]。上述結(jié)果表明抑制GLI1的表達(dá)可有效抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，這提示筆者針對(duì)膠質(zhì)瘤設(shè)計(jì)的GLI1 siRNA可以抑制癌基因的表達(dá)，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供了一種新的思路。

[1] Hui CC,Angers S.Gli proteins in development and disease[J]. Annu Rev Cell Dev Biol,2011,27(7)：513-537.

[2] Atwood SX,Chang AL,Oro AE.Hedgehog pathway inhibition and the race against tumor evolution[J].J Cell Biol,2012,199 (2)：193-197.

[3] Gopinath S,Malla R,Alapati K,et al.Cathepsin B and uPAR regulate self-renewal of glioma-initiating cells through GLI-regulated Sox2 and Bmi1 expression[J].Carcinogenesis,2013,34 (3)：550-559.

[4] Wan Y,Sun G,Wang Z,et al.miR-125b promotes cell proliferation by directly targeting Lin28 in glioblastoma stem cells with low expression levels of miR-125b[J].Neuroreport, 2014,25(5)：289-296.

[5] Dorsett Y,Tuschl T.siRNAs：applications in functional genomics and potentialas therapeutics[J].Nat Rev Drug Discov,2004,3(4)：318-329.

[6] Sanchez P,Hernández AM,Stecca B.Inhibition of prostate cancer proliferation by interference with SONIC HEDGEHOGGLI1 signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(34)：12561-12566.

[7] Tao Y,Mao J,Zhang Q,et al.Overexpression of Hedgehog signaling molecules and its involvement in triple-negative breast cancer[J].Oncol Lett,2011,2(5)：995-1001.

[8] Braun S,Oppermann H,Mueller A,et al.Hedgehog signaling in glioblastoma multiforme[J].Cancer Biol Ther,2012,13(7)：487-495.

[9] Wang X,Venugopal C,Manoranjan B,et al.Sonic hedgehog regulates Bmi1 in human medulloblastoma brain tumor-initiating cells[J].Oncogene,2012,31(2)：187-199.

[10] Epstein DJ.Regulation ofthalamicdevelopmentby sonic hedgehog[J].Front Neurosci,2012,6(4)：57.

[11] Komada M. Sonic hedgehog signaling coordinates the proliferation and differentiation of neural stem/progenitor cells by regulating cellcycle kinetics during developmentofthe neocortex[J].Congenit Anom(Kyoto),2012,52(2)：72-77.

[12] Colvin Wanshura LE,Galvin KE,Ye H,et al.Sequential activation of Snail1 and N-Myc modulates sonic hedgehoginduced transformation of neural cells[J].Cancer Res,2011,71 (15)：5336-5345.

[13] Wong H,Alicke B,WestKA,etal.Pharmacokineticpharmacodynamic analysis of vismodegib in preclinical models of mutational and ligand-dependent Hedgehog pathway activation[J].Clin Cancer Res,2011,17(14)：4682-4692.

[14] Uchida H,Arita K,Yunoue S,et al.Role of sonic hedgehog signaling in migration of cell lines established from CD133-positive malignant glioma cells[J].J Neurooncol,2011,104(3)：697-704.

[15] Jagani Z,Mora-Blanco EL,Sansam CG,et al.Loss of the tumor suppressor Snf5 leads to aberrant activation of the Hedgehog-Gli pathway[J].Nat Med,2010,16(12)：1429-1433.

Silencing GLI1 by siRNA inhibits the proliferation of glioma U87 cells

Ma Jianbo1,Sun Kai2,Ma Chong3,Cao Lei3,Zhao Jianping3,Chen Lukui4.1Southeast University Medical College,Nanjing 210009 China;2Weifang Medical University,Weifang 261053 China;3Department of Neurosurgery,Xuzhou Central Hospital China;4Department of Neurosurgery,Zhongda Hospital Southeast University,Nanjing 210009 China

Chen Lukui,Email:neuro_clk@hotmail.com.

ObjectiveTo investigate the effect of glioma associated oncogene 1(GLI1) reduction by small interference RNAs (siRNA)on cell proliferation and glucose metabolism of U87 glioma cells.MethodssiRNA for GLI1 was transfected into U87 glioma cells to inhibit the expression of GLI1.The non-transfected cells and cells transfected with non-sense siRNA were used as controls.The proliferation of U87 cells was assessed by MTT assay,and the cell cycle stage was detected by flow cytometry.ResultsThe results of Western blotting showed that GLI1’s expression was significantly down-regulated in GLI1 siRNA group compared to the two control groups(P＜0.05);cell proliferation was assessed by MTT assays,cell proliferation was significantly inhibited 3 days after treatment of GLI1 siRNA compared with control groups,and declined with persistently along with the extension of the culture time(P＜0.05);the results of flow cytometry showed that the cell cycle was blocked at G1 phase,and the number of cells in S phase declined significantly compared with control groups(P＜0.05).ConclusionInterference of GLI1 expression can markedly inhibit the proliferation of U87 glioma cells,indicating that GLI1 can serve as a promising therapeutic target for glioma.

GLI1; siRNA; Glioma

2015-06-28)

(本文編輯：張麗)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.05.008

210009南京，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1；261053濰坊，濰坊醫(yī)學(xué)院2；221009徐州，徐州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科3；210009南京，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院神經(jīng)外科4

陳陸馗，Email：neuro_clk@hotmail.com

馬劍波,孫愷,馬沖,等.小分子干擾RNA沉默GLI1基因抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(5)：286-288.