翟曉巧，張曉申，趙振利，范國強(qiáng)

(1.河南省林業(yè)科學(xué)研究院，河南 鄭州450008;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所，河南鄭州450002)

自然界中大約70%的被子植物在進(jìn)化史中經(jīng)歷過1次或1次以上多倍化事件［1］。植物發(fā)生多倍體過程中，一方面在染色體結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)模式發(fā)生了變化［2－6］，另一方面在DNA甲基化水平上也發(fā)生了變化［7～17］。研究表明，多倍體植物具有器官和生物量明顯增大的特征和較強(qiáng)適應(yīng)環(huán)境條件的能力［18，19］。泡桐(Paulownia spp.)是中國重要的速生用材和平原綠化樹種之一，因其獨(dú)特的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性，能與農(nóng)作物間作形成獨(dú)特的生態(tài)復(fù)合系統(tǒng)，在防風(fēng)固沙、改善生態(tài)環(huán)境、保障農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)和提高農(nóng)民生活水平等方面發(fā)揮著重要作用，但現(xiàn)有品種不能完全滿足國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需求。近年來，科技工作者創(chuàng)制的多個四倍體泡桐新種質(zhì)［20－25］，一方面豐富了泡桐的種質(zhì)資源，另一方面也為篩選泡桐新品種提供了材料支撐。目前，雖然開展過四倍體泡桐葉片結(jié)構(gòu)、光合作用和木材特性以及耐干旱脅迫等方面的研究工作［26，27］，但迄今國內(nèi)外還未見四倍體泡桐遺傳特性相關(guān)文章的報道。因此，本研究利用AFLP和MSAP分子標(biāo)記技術(shù)，研究了二倍體白花泡桐及其同源四倍體的遺傳差異及DNA甲基化的變化，以期為闡明四倍體泡桐優(yōu)良特性的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所林木生物技術(shù)實驗室經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑獲得、培養(yǎng)30 d的白花泡桐(Paulownia fortunei)二倍體及其同源四倍體組織培養(yǎng)苗。剪取適量生長狀況良好、大小一致幼苗長約0.5 cm的頂芽用液氮速凍后放于－86℃冰箱內(nèi)備用。組培苗培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃、光照強(qiáng)度 130 μmol·m－2·s－1、光照時間 16 h·d－1。

1.2 試驗方法

1.2.1 泡桐DNA的提取 白花泡桐二倍體及其同源四倍體DNA的提取參照張延召等的［28］方法。

1.2.2 泡桐AFLP和MSAP分析 白花泡桐二倍體及其同源四倍體DNA的AFLP和MSAP擴(kuò)增所需96對引物組合的堿基序列和擴(kuò)增過程序及其產(chǎn)物的電泳分別參照曹喜兵等的［29，30］方法。

1.2.3 電泳凝膠的譜帶分析 AFLP和MSAP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)束、凝膠顯影后，先在UMAX Power-Look 2100XL型掃描儀掃描成像，再分別統(tǒng)計分析不同MMS濃度處理樣品間AFLP和MSAP凝膠譜帶的變化。對MSAP凝膠譜帶來說，H和M分別為EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ雙酶切產(chǎn)物電泳譜帶。每1條譜帶代表1個酶切位點(diǎn)。將譜帶有或無分別記作1或0。將每個DNA樣品的H和M擴(kuò)增譜帶可劃分為4種［種類I(H，M=1，1)，無甲基化發(fā)生;種類Ⅱ(H，M=1，0)，單鏈 DNA外甲基化;種類Ⅲ(H，M=0，1)，雙鏈 DNA內(nèi)甲基化;種類Ⅳ(H，M=0，0)，雙鏈DNA外甲基化］。DNA甲基化類型分為多態(tài)性和單態(tài)性類型。DNA多態(tài)性類型包括:A型(甲基化)、B型(去甲基化)和C型(不定)型。其中，A型中的A1和A2代表DNA重新甲基化(對照樣H和M泳道均有帶，而處理樣僅H或M泳道有帶)，A3和A4代表DNA超甲基化(對照樣僅H或M有一條帶，而處理樣H和M泳道都沒帶)。B型(Bl、B2、B3和 B4)代表DNA去甲基化，DNA甲基化譜帶與A型相反。C型代表DNA甲基化的不確定性(二倍體與四倍體泡桐DNA甲基化差異譜帶無法確定)。單態(tài)性類型為D型(對照樣與處理樣間DNA譜帶相同)。同時，計算樣品的總DNA甲基化水平［(種類Ⅱ+種類Ⅲ)/(種類Ⅰ+種類Ⅱ+種類Ⅲ)×100%］和總DNA甲基化多態(tài)性［(A型+B型+C型)/(A型+B型+C型+D型)×100%］及 DNA單態(tài)性［D型/(A型+B型+C型+D型)×100%］。

2 結(jié)果與分析

2.1 白花泡桐二倍體及其同源四倍體DNA堿基序列變化

由白花泡桐二倍體及其同源四倍體DNA的AFLP擴(kuò)增結(jié)果(圖1)可以看出，白花泡桐二倍體及其同源四倍體的DNA利用同一引物均可在相同的位置擴(kuò)增出相同的條帶，也就是說白花泡桐二倍體及其同源四倍體DNA的AFLP酶切位點(diǎn)沒有發(fā)生變化。AFLP每對引物平均可以擴(kuò)增出50～70條譜帶。雖然白花泡桐二倍體及其同源四倍體的DNA經(jīng)不同引物AFLP擴(kuò)增后，產(chǎn)生片段的大小和數(shù)量存在一定的差異，該結(jié)果說明，白花泡桐二倍體染色體加倍前后DNA堿基序列沒有發(fā)生變化，但同源四倍體白花泡桐DNA的高級結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化。

2.2 白花泡桐二倍體及其同源四倍體總DNA甲基化變化

2.2.1 白花泡桐二倍體及其同源四倍體總DNA甲基化水平變化 白花泡桐二倍體及其同源四倍體的MSAP凝膠電泳譜帶統(tǒng)計結(jié)果(表1)表明，白花泡桐二倍體染色體加倍前后DNA甲基化水平發(fā)生了一定變化。在MSAP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳凝膠上，白花泡桐二倍體擴(kuò)增出的位點(diǎn)達(dá)到2 357個，其中全甲基化位點(diǎn)為283個(占總擴(kuò)增位點(diǎn)的12.01%)、半甲基化位點(diǎn)為564個(占總擴(kuò)增位點(diǎn)的23.93%)、總甲基化位點(diǎn)為847個(占總擴(kuò)增帶數(shù)的35.94%);白花泡桐同源四倍體擴(kuò)增出2 512個位點(diǎn)，其中全甲基化位點(diǎn)數(shù)為325個(占總擴(kuò)增帶數(shù)的12.94%)、半甲基化位點(diǎn)為629個(占總擴(kuò)增位點(diǎn)的25.04%)、總甲基化位點(diǎn)為954個(占總擴(kuò)增帶數(shù)的37.98%)。白花泡桐二倍體及其同源四倍體CCGG位點(diǎn)均以雙鏈甲基化為主，白花泡桐同源四倍體全甲基化水平和半甲基化水平高于其二倍體。該結(jié)果說明，白花泡桐二倍體染色體加倍形成的同源四倍體的DNA發(fā)生了甲基化修飾，這也可能是同源四倍體白花泡桐與其二倍體相比形態(tài)等方面未呈現(xiàn)倍增的重要原因之一。

圖1 白花泡桐二倍體及其同源四倍體的AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物部分SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of partial AFLP amplification products of diploid and tetraploid of Paulownia fortunei

2.2.2 白花泡桐二倍體及其同源四倍體DNA甲基化模式的變化 由白花泡桐二倍體及其同源四倍體MSAP擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜(圖2)及其統(tǒng)計結(jié)果(表2和表3)可以看出，白花泡桐四倍體DNA甲基化模式不同于其二倍體。與二倍體比較，白花泡桐四倍體DNA甲基化(A型)位點(diǎn)數(shù)和去甲基化(B型)位點(diǎn)數(shù)分別為291個(占總甲基化多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)的15.02%)和376個(占總甲基化多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)的19.40%)。總DNA甲基化多態(tài)性為34.78%、單態(tài)性(D型)為65.22% 。這說明白花泡桐同源四倍體的DNA甲基化模式變化頻率小于其二倍體。

圖2 白花泡桐二倍體及其同源四倍體的DNA甲基化模式變化Fig.2 DNA methylation patterns of the diploid and tetraploid Paulownia fortunei

3 討論

植物同源四倍體是其二倍體染色體加倍后形成的新種質(zhì)。從理論上講，同源四倍體的形態(tài)等特征應(yīng)呈現(xiàn)其二倍體的倍增結(jié)果，但實際上并非如此［26，31－34］。有人認(rèn)為，造成該結(jié)果的原因可能與植物二倍體染色體加倍過程中相關(guān)基因發(fā)生突變有關(guān)［35，36］。本試驗中，白花泡桐染色體加倍前后DNA堿基序列沒有發(fā)生變化，這在其它研究中也得出相同的結(jié)果［37－43］。因此，同源四倍體植物DNA堿基序列變化與否不是形態(tài)等特征未呈現(xiàn)其二倍體倍增結(jié)果的主要原因。研究表明，雖然在AFLP水平上沒有檢測到二倍體白花泡桐染色體加倍形成的同源四倍體DNA堿基序列的變化，但四倍體白花泡桐DNA甲基化水平和模式都發(fā)生了變化，并且同源四倍體白花泡桐的DNA甲基化模式變化頻率小于其二倍體。眾所周知，DNA甲基化可在不改變生物基因序列的情況下影響染色體的結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá)水平［44，45］。DNA甲基化常與基因表達(dá)的沉默有關(guān)，而DNA去甲基化則與啟動基因的重新表達(dá)有關(guān)。本研究表明，同源四倍體白花泡的DNA甲基化水平高于其二倍體，四倍體白花泡桐DNA甲基化模式變化頻率小于其二倍體。所以，同源四倍體白花泡桐DNA甲基化變化可能是形態(tài)等特征應(yīng)未呈現(xiàn)其二倍體倍增的主要原因之一。該結(jié)論在西瓜、鴨梨、彎葉畫眉草和百喜草的研究結(jié)果中［14－16，46］得到了驗證。

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