趙曉鋒，呂盼晴，張 珂，2，付忠軍，3，許蒙蒙，彭 倩，李慧敏，楊慧麗，丁 冬

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州450002;2.石河子大學(xué)，新疆石河子832000;3.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶401329)

MicroRNAs(miRNAs)為21～23個核苷酸(nt)片段的、非編碼的、相對分子質(zhì)量較小的RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平基因表達調(diào)控中起關(guān)鍵作用，包括生物代謝［1］、激素反應(yīng)［2］、表觀遺傳控制的轉(zhuǎn)座因子［3］、生物脅迫［4］和非生物脅迫［5］等多個方面.植物miRNAs介導(dǎo)的基因調(diào)控涉及植物發(fā)育多個過程，如器官分化［6］、葉片生長［7］、性別決定［8］、雌 雄 不 育［9］、果 核 形 成［10］、子 粒 灌 漿［11］等.MiRNAs主要通過切割靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控［12］.通過芯片技術(shù)和高通量測序可以快速高效地檢測并鑒定miRNA，而對于miRNA剪切的靶基因鑒定常使用低通量的5’－RACE技術(shù).降解組測序技術(shù)(degradome Sequencing)利用植物miRNA在調(diào)控靶基因的表達時通常與靶mRNA進行幾乎完全的配對的特點，結(jié)合高通量測序技術(shù)、生物信息學(xué)分析和RACE驗證，能夠快速高效鑒定miRNA的靶基因.降解組測序技術(shù)已應(yīng)用于擬南芥(Arabidopsis thaliana)［13］、小立碗蘚(Physcomitrella patens)［14］、水稻(Oryza sativa)［15］、大豆(Glycine max)［16］、葡萄(Vitis vinifera)［17］、黃瓜(Cucumis sativus)［18］、馬鈴薯(Solannum tuberosum)［19］、海 島 棉 (Gossypium barbadense)［20］、泡 桐 (Paulownia australis)［21］及 玉 米(Zea mays)［22］等多種植物miRNA靶基因的檢測。本研究采用降解組測序的方法，分別對昌7－2，鄭58等2個玉米自交系的雌穗發(fā)育5個關(guān)鍵時期取樣，并混樣進行測序分析，以鑒定出與玉米雌穗發(fā)育相關(guān)miRNAs的靶基因，為進一步研究miRNAs在玉米雌穗發(fā)育過程中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料選用2013年4月種植在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭州科教園區(qū)(平均氣溫14.3℃，年均降雨量為640.9 mm)的昌7－2，鄭58等2個玉米自交系材料，每個自交系選生長錐未伸長期，生長錐伸長期，小穗分化期，小花分化期，性器官形成期等5個時期的雌穗進行取樣，每個時期取樣量為30個，取樣后放在－80℃冰箱中保存。

1.2 雌穗組織總RNA提取

用液氮將樣品在研缽中研磨至細碎，轉(zhuǎn)移到用DEPC處理過的 1.5 mL Eppendorf管中，以 100 mg∶1 mL(樣品:TRIzol)的量向管中加入TRIzol溶液，充分搖勻后12 000 r·min－1離心10 min;收集上清液到新的離心管中，加入1/5體積氯仿充分混勻，室溫放置 5 min 后，12 000 r·min－1離心 10 min，收集上清液;再加等體積的異丙醇，放在－20℃冰箱過夜。第2天12 000 r·min－1離心10 min后，倒掉廢液，輕微離心，用移液槍吸除管底殘液，自然干燥10 min;RNA沉淀溶于50 μL DEPC水中，溶解完全后對RNA進行質(zhì)量檢測。

1.3 文庫構(gòu)建與測序

對檢測后的RNA進行降解組測序文庫的構(gòu)建:

1)miRNA靶基因mRNA片段的分選，將3’接頭(adapter)與靶基因mRNA片段的3’端退火互補，獲得含有3’接頭－mRNA連接產(chǎn)物的連接混合物;

2)將步驟1所獲的連接混合物中的3’接頭－mRNA連接產(chǎn)物連上5’接頭反轉(zhuǎn)錄獲得兩端均帶有接頭的靶基因mRNA片段;

3)miRNA靶基因cDNA的擴增:以兩端均帶有接頭的靶基因mRNA片段為模板，進行PCR擴增，凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，切取預(yù)期大小分子并回收，得到靶基因mRNA片段的降解組測序文庫，進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

高通量測序得到的數(shù)據(jù)中去除接頭序列后得到目的序列，應(yīng)用CleaveLand分析軟件將目的序列與玉米的genome進行比對，記錄匹配上的序列舍棄未比對上的序列，通過匹配可以得到被切割mRNA的完整序列信息。計算機分析結(jié)果可以直觀地顯示在mRNA序列的某個位點會出現(xiàn)一個波峰，而該處正是候選的miRNA剪切位點。為了進一步確定miRNA的靶基因，又基于植物miRNA的切割常常發(fā)生在互補位點的第10或11位核苷酸上，因此，取波峰上游和下游各15 nt核苷酸序列產(chǎn)生1個30 nt的序列(t-signature)，將該序列反向互補并與玉米miRNA數(shù)據(jù)庫去匹配，符合要求的匹配則為確定了的miRNA靶基因。

1.5 Real-time PCR 驗證

選取昌7－2，鄭58雌穗在小穗分化期和小花分化期的花序分生組織(inflorescence meristems，IM)分化為成對小穗分生組織(spikelet pair meristems，SPM)、成對小穗分生組織分化為小穗分生組織(spikelet meristems，SM)，小花分生組織(Floral meristems，F(xiàn)M)3 個階段，對 miR159，miR160，miR167，miR169，miR172a，miR172e，miR390 等 7個miRNAs與其靶基因進行了Real-time PCR驗證。Real-time PCR反應(yīng)選用 RR820A試劑盒(Takara，日本)SYBR Green I作為熒光染料，Actin2作為內(nèi)參基因，用Bio-rad IQ5熒光定量PCR儀進行擴增，結(jié)果數(shù)據(jù)用2－△△t法進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 保守miRNA的靶基因及其功能分類

降解組測序后將miRNA序列與mRNA序列的配對預(yù)測結(jié)果和降解組密度文件的結(jié)果相結(jié)合進行靶基因的精確預(yù)測，共發(fā)現(xiàn)16個miRNA家族的95個miRNAs對應(yīng)47個靶基因(P＜0.1)(表1)。

根據(jù)其生物學(xué)功能，對測序檢測到的95個miRNAs作用的47個靶基因進行Gene Ontology(GO)分類，發(fā)現(xiàn)處于細胞核和CCAAT結(jié)合因子復(fù)合體的靶基因占78.5%(圖1－A)，與 miRNA主要在基因轉(zhuǎn)錄后水平進行調(diào)控相一致;參與轉(zhuǎn)錄、DNA依賴、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞分化的靶基因占53.2%(圖1－B)，這些靶基因還與花器官發(fā)育、種子發(fā)育、細胞分裂、分生組織保持、根毛細胞生長、硫酸鹽吸收、生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物過程密切相關(guān);在分子功能方面，與DNA結(jié)合、特殊序列DNA結(jié)合、金屬離子DNA結(jié)合的靶基因占72.9%，同時參與與蛋白結(jié)合、蛋白活性、三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合、三磷酸鳥苷(GTP)、翻譯延伸因子活性調(diào)控(圖1－C)。

表1 昌7－2、鄭58雌穗發(fā)育相關(guān)的miRNA靶基因Table 1 The target genes related to ear development of Chang 7－2 Zheng 58

圖1 玉米雌穗發(fā)育相關(guān)miRNA相應(yīng)靶基因GO統(tǒng)計Fig.1 The dereloping maize ear relevant miRNA target genes GO list

2.2 miRNA及靶基因的表達圖譜

降解組測序數(shù)據(jù)分析表明，每個miRNA對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本一般為多個，其中檢測到miR159的轉(zhuǎn)錄本為7個，參與細胞分化、花器官發(fā)育、DNA結(jié)合等過程;miR160對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本為7個，與蛋白二聚反應(yīng)活性、生長素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等過程相關(guān);而miR167對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本僅1個，與蛋白二聚反應(yīng)活性，生長素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等相關(guān);miR169對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本為20個，與特異序列DNA結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān);miR172a，miR172e對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本各7個，參與細胞分化、種子發(fā)育、花器官發(fā)育、分生組織保持等過程;miR390有3個轉(zhuǎn)錄本，其功能未知(表2)。

選 中 miR159，miR160，miR167，miR169，miR172a，miR172e，miR390 等7 個 miRNAs及其靶基因構(gòu)建其在昌7－2與鄭58中的表達圖譜(圖2)。在昌7－2中miR159呈上升趨勢，而T159沒有明顯變化;miR160，miR167，miR172a呈下降趨勢，而T160先下降后上升，T167，T172a先上升后下降。在鄭58中miR169呈上升趨勢，T169呈下降趨勢;miR159，miR167，miR390沒有明顯變化，而T159，T390呈上升趨勢，T167先上升后下降;miR172a呈下降趨勢，而T172a呈上升趨勢。表明在雌穗發(fā)育過程中存在著復(fù)雜的miRNAs調(diào)控，miRNAs與其靶基因不存在簡單的負線性調(diào)控關(guān)系，并且在不同自交系間也存在著較大的表達調(diào)控差異。

表2 7個miRNAs對應(yīng)的靶基因Table 2 The target genens of the seven miRNAs

3 結(jié)論與討論

降解組測序技術(shù)結(jié)合了高通量測序技術(shù)與生物信息學(xué)分析各自的優(yōu)勢，對細胞或組織中miRNA介導(dǎo)的降解的mRNA剪切片段進行深度測序分析，能夠高效準確篩選出miRNA的靶基因，為研究miRNA以及其對應(yīng)的靶基因的相互關(guān)系提供了有效的手段。采用降解組測序技術(shù)，檢測到在玉米雌穗的發(fā)育過程中16個miRNA家族95個miRNAs對應(yīng)的47個靶基因，多數(shù)存在于細胞核內(nèi)，功能多為轉(zhuǎn)錄翻譯的DNA結(jié)合蛋白，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與生長激素密切相關(guān)。這與在擬南芥及水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)或者預(yù)測的結(jié)果相似［23－26］。

其中一些miRNA已被證明是涉及介導(dǎo)植物激素生長素響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如，在擬南芥中，miR159被發(fā)現(xiàn)特異剪切MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族轉(zhuǎn)錄因子MYB33和MYB65的轉(zhuǎn)錄本，以降低植物對脫落酸(abscisic acid，ABA)的敏感性［27］，這可能有利于植物的生長發(fā)育，本研究測定的miR159靶基因多數(shù)也為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MYB。擬南芥中miR160作用的靶基因為生長素響應(yīng)因子基因(auxin response factors，ARF)ARF10和 ARF16，抑制植物的向性生長［28］，在玉米自交系昌 7 －2，鄭 58 中，miR160 靶標為 ARF8，ARF13，ARF18，ARF22，miR167 的靶標是ARF12，通過生長素作用因子的調(diào)控來調(diào)節(jié)雌穗生長發(fā)育。另外，miR162家族的靶標是基因中心，差異表達的miR162作用于類Dicker酶1(Dicer-Like1，DCL1)，DCL1的同系物是 miRNA積累所需物［29］。

圖2 7個miRNA及其靶基因的差異表達圖譜Fig.2 Expression profiles of 7 miRNAs and the target genes

本研究中，測定的miRNA156，miR172在先前研究中顯示在植物發(fā)育的整個階段起作用，從最早的花誘導(dǎo)形成階段到最終的性器官形成。miR172主要通過靶基因調(diào)控花器官的形成和花模式，miR172功能的缺失將延遲花的發(fā)育或造成花發(fā)育異常，相比之下，過表達的miR172將導(dǎo)致花期提前［30］，而在玉米雌穗發(fā)育過程中miR172可能對花器官的形成也起到關(guān)鍵的調(diào)控，在玉米中miR156 a－l從玉米幼穗到成熟過渡階段可能作用于幾個Squamosa啟動子結(jié)合蛋白基因(squamosa promoter binding protein like genes，SPL)，可能是通過SPL 間接地激活miR172。miR172已被證明能夠下調(diào)基因光澤15(Glossy15，GL15)，促進幼穗階段的維持［31］。同時miR172e可能會控制無限小穗1(Indeterminate Spikelet 1，IDS 1)和姊妹無限小穗1(Sister Indeterminate Spikelet 1，SID 1)，通過翻譯抑制和mRNA降解方式，對玉米小穗性別和莖尖細胞分化起決定作用。除了miR156和miR172，miR164靶基因編碼無頂端分生組織(No Apical Meristem，NAM)蛋白，可能參與調(diào)節(jié)雌穗發(fā)育［32－35］。miR390通過切割反式作用干擾小 RNA(tasiRNA，TAS)產(chǎn)生多片段，這些片段在一系列RNA酶作用下，形成 TAS，靶向 ARF2，ARF3和ARF4，參與植物生長發(fā)育調(diào)控［36，37］。本研究通過混合樣品測序分析，鑒定出與玉米雌穗發(fā)育相關(guān)miRNA的靶基因，為進一步研究miRNA及其靶基因在玉米雌穗發(fā)育過程中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

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