張 凱，雷振山，王亞莉

(信陽農(nóng)林學院，河南 信陽464000)

種子的萌發(fā)是作物生長的關鍵時期，種子發(fā)芽時期和質量好壞直接影響農(nóng)作物的生長和經(jīng)濟效益。在以往的研究中，如何促進種子的萌發(fā)一直是人們關注的主要話題，但是，抑制種子的萌發(fā)同樣具有實用價值和研究意義。例如，水稻在收獲前如遇高溫多濕天氣，往往發(fā)生穗上萌發(fā)［1］，這不僅造成水稻產(chǎn)量下降，同時還影響種子質量和經(jīng)濟效益，因此，如何防止種子穗上萌發(fā)已是雜交水稻生產(chǎn)實際中亟需解決的問題。種子的萌發(fā)受許多因素的影響，包括環(huán)境因子、激素水平、種子活力等［2］，其中，激素對種子萌發(fā)的影響一直是研究熱點。ABA通常被認為是抑制型植物激素，與植株衰老和器官(葉、蕾、鈴)脫落有密切聯(lián)系［3］。但近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，ABA對大豆和水稻等作物子粒的休眠和萌發(fā)具有調控作用［4－5］，GA可以促進基因表達，增加植物種子水解酶的合成而促進種子萌發(fā)。已有研究表明，內(nèi)源ABA可通過抑制水解酶的含量而誘導種子休眠［6］。miRNA是一類長21～25 bp具有調控功能的非編碼小分子RNA。研究表明，OsmiR156能夠負調控水稻種子的產(chǎn)量和穗分枝數(shù)［7－8］。與其相反，OsmiR397正調控種子的發(fā)育，研究顯示，過表達OsmiR397能夠增大水稻種子的體積，進而提高水稻的產(chǎn)量［9］。在擬南芥中，ABA通過誘導與擬南芥種子發(fā)育相關miR159的表達，抑制miR159兩個靶基因的表達，進而影響擬南芥種子的萌發(fā)［10］。同樣作為模式植物的水稻，其種子的發(fā)育同樣受到miRNA的精細調控［10－12］，且已有水稻種子發(fā)育相關的miRNA被分離和鑒定;但尚未有關于ABA對種子發(fā)育相關的miRNA表達量的影響及其調控種子活力、影響種子萌發(fā)的研究報道。為此，本研究分析了外源施加不同質量濃度ABA對于水稻種子萌發(fā)、內(nèi)源ABA含量和內(nèi)源GA含量和與種子發(fā)育相關的OsmiR156和OsmiR397表達量的影響，旨在進一步揭示ABA對水稻種子萌發(fā)的生理和分子效應，為深入認識種子萌發(fā)的分子調控機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

收集河南省2014年大田種植的由信陽市農(nóng)科所通過培矮64 S×豫粳3號雜交培育而成的粳稻品種兩優(yōu)信粳1號種子，4℃儲藏備用。試劑ABA購至sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發(fā)活力測定 選取健康飽滿的水稻種子經(jīng)0.5%NaClO消毒25 min后，反復沖洗干凈。用不同質量濃度 (0，10，20，40，80 mg·L－1)ABA浸種24 h，浸后的種子用清水沖洗干凈，然后于30℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)6 d。第2天開始發(fā)芽計數(shù)，計數(shù)時把發(fā)芽合格的種子從發(fā)芽床中揀出，記錄每天揀出種子數(shù)，即為新發(fā)芽種子數(shù)，直至6 d。分別在第3天的統(tǒng)計種子的發(fā)芽勢，在第6天用游標卡尺分別測量根和地上部分的長度，統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)［13］。種子以100粒為1重復，試驗重復4次。

1.2.2 通過采用高效液相色譜法測定種子內(nèi)源ABA和GA質量濃度 樣品提取:稱取1.0 g左右經(jīng)ABA浸種24 h后水稻種子，液氮研磨，加入含有5 mL銅試劑(30 mg·L－1)的冷乙腈，在4℃冰箱中提取 12 h，5 000 r·min－1離心 15 min，取上清液。再重復提取2次，最后合并上清液。在37～40℃條件下進行旋轉蒸發(fā)直干，用2 mL三氯甲烷和0.4 mol·L－1磷酸緩沖液 2 mL，以去除色素，重復3次，合并溶液，取上清液，加入150 mg聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)除去酯類，10 000 r·min－1離心 15 min，然后在 37 ～40 ℃ 條件下進行旋轉蒸發(fā)直干，用1 mL流動相［V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(0.6%乙酸)=50∶45∶5］溶解，用孔徑為0.45 μm的有機濾膜過濾，上機分析。所用分析柱為 Symmetry C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫為25 ℃，流動相流速0.4 mL·min－1，檢測波長為254 nm。

1.2.3 種子miRNA含量提取及表達量檢測 總RNA提取:稱取1.0 g左右經(jīng)不同質量濃度ABA浸種24 h后水稻種子，液氮研磨，裝入1.5 mL EP管中;然后參照TAKARA公司RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)說明提取水稻種子總RNA。

cDNA的合成:取1μg總 RNA，按照 TaKARA公司One Step PrimeScript MiRNA cDNA Synthesis Kit說明進行cDNA第1條鏈的合成。cDNA合成后先通過普通PCR進行檢驗逆轉錄是否成功，然后把剩余cDNA存放于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

半定量RT-PCR驗證OsmiR156和OsmiR397的表達量變化:為了準確檢測 OsmiR156和OsmiR397的表達量，以水稻U6做為內(nèi)參照基因，對不同的模板樣品進行均一化處理。然后對各樣品中OsmiR156和OsmiR397進行RT-PCR檢測。引物 采 用 前 人 研 究 報 道 的 OsmiR156［8］和OsmiR397［9］正向引物，引物序列如下:U6正向引物:5'-CGATAAAATTGGAACGATACAGA-3';反向引物:5'-ATTTGGACCATTTCTCGATTTGT-3';OsmiR397正向引物:5'-GTTCATCAACGCTGCACTCAA-3'，OsmiR156 正向引物:GTGCTCACTCTCTTCTGTCA，反向引物由試劑盒提供。反應程序如下:94℃ 預變性1 min，94℃ 變性30 s，55℃退火30 s，7 2 ℃ 延伸 30 s，72 ℃ 延伸 10 min。取 1 μL轉錄產(chǎn)物用1%膠檢測。

2 結果與分析

2.1 外源ABA對水稻種子發(fā)芽指標的影響

圖1 不同質量濃度ABA處理對水稻種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of treatment with different concentrations of ABA on the vigor of rice seeds

經(jīng)外源ABA浸泡處理后，水稻種子的發(fā)芽勢發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)有明顯影響(圖1)。質量濃度10 mg·L－1的ABA處理種子的發(fā)芽勢比對照顯著提高了6.2%;發(fā)芽率、相對發(fā)芽率分別比對照提高了5.8%和6.5%，而且種子的活力指數(shù)也提高7.1%，與對照差異達到顯著水平。然而隨著ABA質量濃度的提高，水稻種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)明顯下降，并且與CK差異達極顯著水平。同時各處理間處理質量濃度越高，發(fā)芽勢越低，抑制萌發(fā)效果越好。尤其當ABA質量濃度達到40 mg·L－1與低于該質量濃度的各處理(包括 CK)差異達極顯著水平，而與80 mg·L－1處理差異不顯著，發(fā)芽率和種子活力分別降低到78.5%和67.7%，結果表明，不同質量濃度ABA處理對水稻種子萌發(fā)的影響表現(xiàn)為低質量濃度促進發(fā)芽，高質量濃度抑制發(fā)芽。

2.2 外源ABA對水稻種子內(nèi)源ABA和GA質量濃度的影響

水稻種子經(jīng)不同質量濃度外源ABA浸泡處理后，內(nèi)源ABA和GA含量出現(xiàn)明顯變化。表現(xiàn)為低質量濃度處理使種子內(nèi)源ABA降低，高質量濃度處理使種子內(nèi)源ABA含量升高，而GA表現(xiàn)為相反的趨勢。結果如圖2所示，外源ABA質量濃度低于20 mg·L－1時，內(nèi)源ABA含量與CK相比顯著降低，并隨質量濃度提高而降低;但當外源ABA質量濃度高于20 mg·L－1時，內(nèi)源ABA含量與對CK比顯著增加。增加幅度最大為40 mg·L－1，比CK增加1.78倍，并且與CK差異達極顯著水平。當外源ABA質量濃度進一步提高達到80 mg·L－1時，內(nèi)源 ABA的增加趨勢則不明顯。對于內(nèi)源GA來說，各處理的GA含量均顯著降低。與CK相比，質量濃度10 mg·L－1降低幅度最小，質量濃度80 mg·L－1降低幅度最大。進一步分析內(nèi)源ABA與GA含量的比值發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過不同質量濃度的ABA處理以后，各處理水稻種子內(nèi)源ABA/GA的值均高于CK。而且隨著外源ABA質量濃度的提高，這個比值逐漸提高。與CK相比，質量濃度10 mg·L－1增加幅度較小，為2.43倍，而質量濃度80 mg·L－1增幅達到CK的21.84倍(圖3)。

圖2 不同質量濃度ABA處理對水稻種子ABA和GA含量的影響Fig.2 Effects of treatment with different concentrations of ABA on the levels of GA and ABA in rice seeds

圖3 不同質量濃度外源ABA處理后水稻種子內(nèi)源ABA/GA值Fig.3 Effects of treatment with different concentrations of ABA on the levels of ABA/GA in rice seeds

2.3 不同質量濃度外源ABA處理對水稻種子中OSmiR156和OSmiR397表達量的影響

RT-PCR如圖4結果所示，水稻種子經(jīng)10 mg·L－1的ABA浸泡處理后，促進種子發(fā)育的OSmiR397的表達量明顯較對照升高，表明質量濃度10 mg·L－1ABA浸泡提高了水稻種子的活力，增強種子萌發(fā)的潛力。這與質量濃度10 mg·L－1ABA處理促進種子萌發(fā)的結果相印證，并為其提供了分子水平的證據(jù)。但當外源ABA質量濃度高于40 mg·L－1時，OSmiR397的表達量較對照相比下降了，而且隨著 ABA質量濃度的升高，OSmiR397的表達量隨之下降，尤其當質量濃度達到80 mg·L－1時，OSmiR397的表達量幾乎檢測不到。另一方面，ABA對于OSmiR156的表達有明顯抑制作用，且隨著外源ABA質量濃度的提高，抑制作用越明顯。這表明ABA對于調控OSmiR156和OSmiR397表達呈現(xiàn)不同的機制。

圖4 RT-PCR分析不同質量濃度ABA處理對水稻種子OSmiR156和OSmiR397表達量的影響Fig.4 RT-PCR analysis the effects of treatment with different concentrations of ABA on the expression levels OSmiR156 and OSmiR397 on t in rice seeds

3 討論

除了環(huán)境因子對種子的萌發(fā)就有顯著影響外，植物激素對種子萌發(fā)的影響也十分劇烈［2，10］。作為一種重要的植物激素，ABA對調節(jié)水稻種子的萌發(fā)起著重要的作用。已有的研究表明，GA則可誘導產(chǎn)生或激活α－淀粉酶等水解酶而促進種子的萌發(fā)，ABA可以調節(jié)或抑制一些水解酶的活性而有利于淀粉和蛋白質的合成和積累而不利于種子的萌發(fā)［14，15］。黃宇等［16］認為，一定質量濃度的ABA對于水稻種子的萌發(fā)和幼苗生長有顯著的促進作用。徐福樂等認為，一定質量濃度ABA浸種能夠延緩或抑制作物種子的萌發(fā)進程，但不影響作物種子的最終萌發(fā)率，而低質量濃度ABA可以促進種子萌發(fā)，促進幼苗根的伸長，增加根鮮質量和根葉比［17］。

本研究結果顯示，經(jīng)外源ABA處理后，在小于等于10 mg·L－1的低質量濃度下ABA促進種子的萌發(fā)，這與前人的研究結果相一致。而大于或等于20 mg·L－1質量濃度下，種子的萌發(fā)率明顯降低。并且一定范圍內(nèi)質量濃度越大，降低越明顯。而且分析與種子萌發(fā)密切相關的內(nèi)源激素ABA和GA發(fā)現(xiàn)，外源ABA處理對于種子內(nèi)源激素影響也很明顯，尤其會導致ABA/GA的比值升高，一定范圍質量濃度越高，升高幅度越明顯。而已有的研究證明ABA/GA 比值高則不利于種子萌發(fā)［15－17］，進一步檢測與種子發(fā)育相關的miRNA表達量的變化發(fā)現(xiàn)，低于等于20 mg·L－1質量濃度外源ABA處理能夠提高與種子發(fā)育正相關OSmiR397的表達，預示著種子活力的提高，反之，高于20 mg·L－1質量濃度能夠抑制其表達，表明種子活力降低。這也與萌發(fā)試驗的結果相一致。而OSmiR156的表達在ABA處理后一直呈下降趨勢。表明與OSmiR397響應ABA調控的模式不完全一致，ABA負調控OSmiR156的表達。這種負調控模式與擬南芥中ABA誘導miR159的表達模式相反［8］。

綜上所述，外源ABA噴施在水稻的生產(chǎn)上具有廣闊的應用前景。外源施加低質量濃度的ABA能夠很好促進種子的萌發(fā)，提高成苗率;外源施加高質量濃度的ABA能夠顯著降低種子的萌發(fā)，這可能很好地解決水稻穗上萌發(fā)等問題。所以，進一步地做好ABA試驗、推廣、應用工作對于提高水稻的產(chǎn)量和品質具有重要的意義。

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