郭占芳，梁向黨，鄒秀強，孫 賡，余寬寬，房卓群

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·論著·

血流動力學(xué)變化對大鼠頸動靜脈移植血管重構(gòu)影響的研究

郭占芳，梁向黨*，鄒秀強*，孫 賡，余寬寬，房卓群

目的 血流動力學(xué)差異對大鼠動靜脈移植后血管重構(gòu)的影響。方法 取40只SD大鼠，隨機分為實驗組和對照組，每組各20只。實驗組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm移植到大鼠右側(cè)頸外靜脈；對照組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm切除后原位移植。分別于術(shù)后第1、2、4周進行大體觀察、血管超聲檢查、血管內(nèi)膜厚度觀察、細(xì)胞增生情況觀察、細(xì)胞凋亡情況觀察。結(jié)果 兩組大體觀察血流均通暢。超聲檢查顯示實驗組血流信號較弱。實驗組各觀察時間點血管內(nèi)膜厚度均低于對照組(P<0.05)，術(shù)后第1、2周兩組增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩組各觀察時間點凋亡指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 大鼠動脈血管移植后，血流動力差異導(dǎo)致血管內(nèi)膜呈現(xiàn)萎縮和增生不同結(jié)果，細(xì)胞的凋亡和增生發(fā)揮了重要作用。動脈血管移植到靜脈后，血管重構(gòu)符合靜脈血流動力學(xué)特點。

血流動力學(xué)；血管移植術(shù)；血管內(nèi)膜；大鼠

20世紀(jì)初，“血管外科之父”Guthrie和Carrel成功實施了靜脈移植到動脈的血管移植手術(shù)[1]。然而血管移植的成功率較低，目前大隱靜脈移植后10年的通暢率僅為50%～60%。血管移植后狹窄和再狹窄仍是當(dāng)前血管移植失敗的主要原因，關(guān)于血管移植后狹窄和再狹窄機制的研究一直沒有停止過[2]。Zarins等[3]在30年前就提出了血流動力學(xué)差異是引起移植血管狹窄和再狹窄的重要原因，現(xiàn)在這一觀點已經(jīng)是眾所周知。血管移植后狹窄和再狹窄的病理變化主要表現(xiàn)為近期的血栓形成和血管內(nèi)膜增生，以及遠(yuǎn)期的血管粥樣硬化[4]，而移植后血管內(nèi)膜增生又是血栓發(fā)生和血管粥樣硬化的重要誘發(fā)因素。有研究認(rèn)為血流動力學(xué)差異致使血管內(nèi)膜增生，進而引起血管狹窄，其中高剪切力和高周張力在促進靜脈橋血管內(nèi)膜增生方面發(fā)揮了重要作用[5]。目前靜脈橋血管內(nèi)膜增生的病理生理機制仍未完全清楚，大多數(shù)研究仍主要集中于臨床應(yīng)用較多的靜脈移植到動脈的實驗研究[6-10]。但動脈移植到靜脈后，動脈橋血管在低剪切力和低周張力條件下的變化研究較少，特別是小動脈移植到小靜脈后，血流動力學(xué)差異對血管重構(gòu)影響的報道較少。筆者利用大鼠頸動靜脈血流動力學(xué)自然差異，建立頸總動脈移植到頸外靜脈的血管移植模型，對小動脈靜脈化過程進一步研究，為血流動力學(xué)變化對血管重構(gòu)影響機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和儀器 健康成年雄性SD大鼠，共40只，體重300～350 g，解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供[SCXK(京)2011-0004]；超聲診斷儀(美國Logiq 3 EXP)，組織切片機(德國Leica)，光學(xué)顯微鏡及照相裝置(日本Nikon)。

1.2 實驗方法 將40只SD大鼠隨機分為實驗組與對照組，每組各20只,1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，按35 mg/kg計算用量，仰臥于手術(shù)臺上，通過頸部正中切口，切開皮膚、淺筋膜和頸闊肌，暴露頸總動脈和頸外靜脈，顯微鑷游離頸總動脈和頸外靜脈。實驗組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm移植到大鼠右側(cè)頸外靜脈，結(jié)扎左側(cè)頸總動脈；對照組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm切斷后原位移植。血管移植采用傳統(tǒng)針線縫合方法，縫線為10-0絲線。逐層縫合手術(shù)切口，關(guān)閉切口，手術(shù)時間90 min內(nèi)?？p合切口前用青霉素40萬U和生理鹽水沖洗切口，術(shù)后100 IU/ml肝素鹽水皮下注射3 d。術(shù)后第1周兩組各處死6只大鼠，術(shù)后第2周處死6只，術(shù)后第4周處死8只。術(shù)后第1周血管超聲發(fā)現(xiàn)對照組5例栓塞，行血管移植吻合術(shù)5例，進行補充。

1.3 觀察方法

1.3.1 大體觀察：術(shù)后第1、2、4周，用相同方法腹腔注射麻醉，手術(shù)臺上暴露頸總動脈和頸外靜脈，觀察兩組移植或游離血管大體損傷情況，分別行血流夾斷通暢實驗。

1.3.2 血管超聲檢查：分別于術(shù)前及術(shù)后第1、2、4周，用超聲診斷儀行頸總動脈和頸外靜脈檢查，觀察血管血流通暢情況并行記錄。

1.3.3 組織學(xué)觀察：兩組在移植血管遠(yuǎn)、近端吻合口處，長1 cm，用帶滑竿血管夾夾持兩端，眼科剪橫斷血管，用生理鹽水沖洗離體血管，置于10%福爾馬林中，8 h后行沖洗、脫水、浸蠟，石蠟包埋，預(yù)切厚度5 μm，組織切片，脫水、透明、HE染色、中性樹膠固定。樹膠凝固干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，用圖像分析軟件，測量移植血管內(nèi)膜厚度。

1.3.4 抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性細(xì)胞和凋亡細(xì)胞表達：應(yīng)用PCNA抗體 [Anti-PCNA抗體(PC10)ab29]，觀察細(xì)胞增生情況，免疫組化染色，定位細(xì)胞核，細(xì)胞核顯示棕黃色為抗PCNA陽性細(xì)胞表達。隨機計數(shù)血管內(nèi)膜500個細(xì)胞內(nèi)陽性細(xì)胞比例。同樣末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)測量法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核顯示棕黃色為凋亡細(xì)胞表達，隨機計數(shù)血管內(nèi)膜500個細(xì)胞內(nèi)陽性細(xì)胞比例。實驗步驟參照試劑說明書。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 術(shù)后第1、2、4周行大體觀察，實驗組右側(cè)頸外靜脈和對照組左側(cè)頸總動脈血管紅潤，行夾斷通暢實驗，兩組血管血流均通暢。動物處死后血管縱向切開觀察。實驗組：術(shù)后第1周，血管內(nèi)膜缺損較嚴(yán)重；術(shù)后第2周，血管內(nèi)膜較前光滑；術(shù)后第4周，血管內(nèi)膜缺損無變化。對照組：術(shù)后第1周,血管內(nèi)膜缺損嚴(yán)重；術(shù)后第2周，血管內(nèi)膜較前光滑；術(shù)后第4周，血管內(nèi)膜進一步修復(fù)。

2.2 血管超聲檢查 術(shù)后第1、2、4周超聲檢查，實驗組右側(cè)頸外靜脈血流弱，超聲血流信號較弱。對照組左側(cè)頸總動脈血流通暢。實驗組：術(shù)后第1周，吻合段管腔較術(shù)前輕度變大；術(shù)后第2周，吻合段管腔較術(shù)前變小；術(shù)后第4周，吻合段管腔較術(shù)前變大。對照組：術(shù)后第1周，吻合段管腔較術(shù)前輕度變?。恍g(shù)后第2、4周，吻合段管腔變化不明顯。

2.3 組織學(xué)觀察 術(shù)后第1周，實驗組內(nèi)膜輕度變薄，對照組內(nèi)膜輕度增厚，中膜和外膜均無變化；術(shù)后第2周，實驗組內(nèi)膜變薄，中膜和外膜無明顯變化，對照組內(nèi)膜輕度增厚，中膜和外膜無明顯變化；術(shù)后第4周，實驗組內(nèi)膜厚度明顯變薄，中膜厚度輕度變薄，外膜無變化，對照組內(nèi)膜、中膜和外膜同前無明顯變化，見圖1。實驗組各觀察時間點血管內(nèi)膜厚度均低于對照組(P<0.05)，見表1。

2.4 PCNA指數(shù)和凋亡指數(shù) 實驗組血管內(nèi)膜：術(shù)后第1周，抗PCNA陽性細(xì)胞有部分表達，凋亡細(xì)胞部分表達；術(shù)后第2周，抗PCNA陽性細(xì)胞有少量表達，凋亡細(xì)胞大量表達；術(shù)后第4周，抗PCNA陽性細(xì)胞有極少量表達，凋亡細(xì)胞較多表達。對照組血管內(nèi)膜：術(shù)后第1周，抗PCNA陽性細(xì)胞有部分表達，凋亡細(xì)胞少量表達；術(shù)后第2周，抗PCNA陽性細(xì)胞有部分表達，凋亡細(xì)胞極少量表達；術(shù)后第4周，抗PCNA陽性細(xì)胞有少量表達，凋亡細(xì)胞極少量表達，見圖2、3。術(shù)后第1、2周兩組PCNA指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，術(shù)后第4周，兩組PCNA指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組術(shù)后第1、2、4周凋亡指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 術(shù)后兩組大鼠血管內(nèi)膜厚度變化

注：實驗組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm移植到大鼠右側(cè)頸外靜脈，對照組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm切斷后原位移植；兩組術(shù)后第1周各處死6只大鼠，術(shù)后第2周處死6只，術(shù)后第4周處死8只；與對照組比較，aP<0.05

表2 術(shù)后兩組大鼠血管內(nèi)膜PCNA指數(shù)和凋亡指數(shù)比較

注：PCNA為增殖細(xì)胞核抗原；實驗組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm移植到大鼠右側(cè)頸外靜脈；對照組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm切斷后原位移植；兩組術(shù)后第1周各處死6只大鼠，術(shù)后第2周處死6只，術(shù)后第4周處死8只；與對照組比較，aP<0.05

圖1 兩組大鼠血管鏡下病理學(xué)形態(tài)(HE×400)

實驗組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm移植到大鼠右側(cè)頸外靜脈；對照組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm切斷后原位移植。A.實驗組術(shù)后第1周；B.實驗組術(shù)后第2周；C.實驗組術(shù)后第4周；D.對照組術(shù)后第1周；E.對照組術(shù)后第2周；F.對照組術(shù)后第4周

3 討論

血管移植后在不同應(yīng)力條件下重建的差別很大。以前研究大多集中于靜脈移植到動脈后在高剪切力和高周張力條件下動脈化重建情況，認(rèn)為高剪切力對靜脈內(nèi)膜損傷嚴(yán)重，引起血栓形成和內(nèi)膜明顯增生。高周張力則對血管中膜增厚影響較大[11]。靜脈移植到動脈后引起血流動力學(xué)變化，機械力受體接收信號并向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)，分泌有絲分裂原因子，引起血管平滑肌細(xì)胞表型變化，細(xì)胞異常增生和遷徙到內(nèi)膜，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)則為細(xì)胞增生和遷徙提供支持，引起血管內(nèi)膜增生[12]。動脈和靜脈結(jié)構(gòu)有一定差異，動脈中膜平滑肌層更厚，靜脈中膜缺乏內(nèi)彈力板[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，動靜脈平滑肌細(xì)胞功能也有差異。靜脈平滑肌細(xì)胞在不同血流條件下，更容易出現(xiàn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，血小板衍生生長因子和轉(zhuǎn)移生長因子等分泌較多，細(xì)胞增殖更快[14]。因此，我們認(rèn)為血管重構(gòu)既有血流動力學(xué)差異影響，也有動靜脈解剖結(jié)構(gòu)及血管平滑肌細(xì)胞功能差異的影響。

圖2 兩組大鼠血管抗增殖細(xì)胞核抗原陽性細(xì)胞表達(免疫組化染色×400)

實驗組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm移植到大鼠右側(cè)頸外靜脈；對照組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm切斷后原位移植。A.實驗組術(shù)后第1周；B.實驗組術(shù)后第2周；C.實驗組術(shù)后第4周；D.對照組術(shù)后第1周；E.對照組術(shù)后第2周；F.對照組術(shù)后第4周；細(xì)胞核顯示棕黃色為抗增殖細(xì)胞核抗原陽性細(xì)胞表達。

圖3 兩組大鼠血管凋亡細(xì)胞表達(TUNEL×400)

實驗組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm移植到大鼠右側(cè)頸外靜脈；對照組取大鼠左側(cè)頸總動脈1 cm切斷后原位移植。A.實驗組術(shù)后第1周；B.實驗組術(shù)后第2周；C.實驗組術(shù)后第4周；D.對照組術(shù)后第1周；E.對照組術(shù)后第2周；F.對照組術(shù)后第4周；細(xì)胞核顯示棕黃色為凋亡細(xì)胞表達

有研究通過降低動脈血流量，探討動脈血管在低血流量情況下血管重構(gòu)機制，Meyerson等[15]通過結(jié)扎動脈分支的方法降低血流量，有學(xué)者通過動脈外套管的方法降低血流量，發(fā)現(xiàn)低血流和低張力導(dǎo)致動脈內(nèi)膜明顯增生。由此得出結(jié)論，低血流是內(nèi)膜增生的重要影響因素[16-17]。筆者通過建立大鼠頸總動脈移植到頸外靜脈的低血流血管重構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)低血流條件下血管重構(gòu)不同于靜動脈移植，也不同于結(jié)扎支流后動脈低血流條件下重構(gòu)變化。動靜脈移植后，低血流條件下無血栓發(fā)生，通暢率100%。通過HE染色組織學(xué)病理觀察，Image Pro PluS圖像分析軟件測量移植血管內(nèi)膜厚度。發(fā)現(xiàn)動脈橋血管內(nèi)膜經(jīng)歷了損傷后輕度增生，然后內(nèi)膜中膜和外膜逐漸萎縮變薄。實驗組和對照組比較，兩組血管內(nèi)膜厚度變化差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。動靜脈移植后，血管壁逐漸變薄，動脈橋血管口徑逐漸變大，呈現(xiàn)了動脈靜脈化的變化，血管代償重建進而順應(yīng)靜脈血流的自然特點。細(xì)胞增生凋亡機制紊亂是低血流條件下血管壁萎縮變薄的重要原因。通過對兩組各觀察時間點PCNA指數(shù)和凋亡指數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)術(shù)后第1、2周實驗組PCNA指數(shù)低于對照組，術(shù)后第4周兩組PCNA指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各觀察時間點凋亡指數(shù)實驗組均大于對照組。動脈原位移植后，術(shù)后第1、2周表現(xiàn)為動脈損傷后增生修復(fù)，術(shù)后第4周細(xì)胞增生不明顯。動靜脈移植后，各觀察時間主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，動脈移植到靜脈術(shù)后第1周，血管內(nèi)膜出現(xiàn)凋亡細(xì)胞；術(shù)后第8周，血管中膜出現(xiàn)凋亡細(xì)胞；術(shù)后第12周，血管外膜出現(xiàn)凋亡細(xì)胞[18-19]。然而相關(guān)研究沒有觀察細(xì)胞增生情況，對照組未進行血管移植。但血管壁萎縮變薄的結(jié)果與我們研究結(jié)果相同。筆者分析血流量降低幅度不同是影響血管重構(gòu)結(jié)果差異的重要原因，另外靜脈無搏動特點也促進血管壁逐漸萎縮，也符合靜止抑制增生理論。我們以前研究移植血管外固定架技術(shù)時，發(fā)現(xiàn)血管搏動對血管重構(gòu)有一定影響[20]。并且動靜脈血(如含氧量)自身差異也對重構(gòu)結(jié)果有重要影響。

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Effect of Hemodynamic Change on the Vascular Reconstruction after Cervical Arteriovenous Transplantation in Rats

GUO Zhan-fang1, LIANG Xiang-dang1, ZOU Xiu-qiang1, SUN Geng2, YU Kuan-kuan1, FANG Zhuo-qun1

(1. The First Department of Osteology, General Hospital of the PLA, Beijing 100853, China; 2. Department of Thoracic Surgery, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China)

Objective To explore the effects of hemodynamic differences on the vascular reconstruction after cervical arteriovenous transplantation in rats. Methods A total of 40 SD rats were randomly divided into experimental group (n=20) and control group (n=20). In experimental group, 1cm of left common carotid artery was transplanted into the right external jugular vein; in control group, 1cm of left common carotid artery was resected and transplanted in situ. General observation, vascular ultrasound, observations of vascular intimal thickness, cellular hyperplasia and cellular apoptosis were performed in postoperative 1st, 2ndand 4thweeks. Results The blood flow were smooth during general observation in the both groups, and ultrasonography showed that the signal of blood flow in experimental group was weaker than that in control group. The values of intimal thickness on all time points in experimental group were significantly lower than those in control group (P<0.05), and the differences in proliferating cell nuclear antigen (PCNA) indexes in postoperative 1stand 2ndweeks were statistically significant (P<0.05), and the differences in apoptotic indexes in all time points were also statistically significant (P<0.05). Conclusion After arterial transplantation, hemodynamic differences lead to intimal atrophy or hyperplasia, in which cellular apoptosis and hyperplasia play an important role. After the artery being transplanted into venous, vascular remodeling in venous is in accord with hemodynamic characteristics.

Hemodynamics; Vascular grafting; Tunica intima； Rats

科技部國際合作項目(2014DFA31230)

100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科一病區(qū)(郭占芳、梁向黨、鄒秀強、余寬寬、房卓群)；071000 河北 保定,解放軍252醫(yī)院骨科(孫賡)

梁向黨，E-mail：lxd301@263.net

R-332

A

2095-140X(2015)03-0032-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.008

2014-12-22 修回時間:2015-01-30)

*為共同第一作者