謝艷芳，陳克明，馬小妮，石文貴，周 建

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骨科基礎(chǔ)研究

·論著·

大鼠顱骨成骨細胞和骨細胞的分離純化與比較研究

謝艷芳，陳克明，馬小妮，石文貴，周 建

目的 探討大鼠顱骨中骨細胞和成骨細胞的分離純化方法，并分別比較細胞形態(tài)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活性和成骨特異性蛋白的表達情況。方法 分別采用序列酶消化和EDTA螯合法，從SPF級新生SD大鼠的顱骨中分離培養(yǎng)骨細胞和成骨細胞，對其進行HE染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色、骨鈣素(BGP)免疫熒光染色；采用偶氮偶合法對兩種細胞ALP進行染色，并檢測其活性；應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測兩種細胞的Ⅰ型膠原和BGP的表達量。結(jié)果 細胞形態(tài)學(xué)觀察及HE染色表明，骨細胞多呈星狀或樹枝狀且有較多突觸，而成骨細胞呈長梭形且突觸較少；Ⅰ型膠原免疫組化染色與Western blot結(jié)果表明，Ⅰ型膠原在成骨細胞中表達量較高，呈棕黃色，骨細胞中表達量較低；而BGP免疫熒光染色與Western blot顯示，成骨細胞中BGP表達較低，而在骨細胞中表達較高，細胞熒光染色與HE染色結(jié)果相似；ALP染色結(jié)果表明，ALP在成骨細胞中表達較高，骨細胞中表達較低；ALP活性檢測與ALP染色結(jié)果相似。結(jié)論 采用序列酶消化及EDTA螯合法，可以從大鼠顱骨中分離得到較純的骨細胞及成骨細胞，利用HE染色、免疫組化、免疫熒光染色、Western blot等技術(shù)，可以對骨細胞和成骨細胞進行分離純化與研究。

骨細胞；成骨細胞；免疫組化；膠原Ⅰ型；骨鈣素;大鼠, Sprague-Dawley

成骨細胞作為骨修復(fù)與骨重建的主要承擔(dān)者，被認為是藥物、電磁場等治療骨質(zhì)疏松癥研究的基礎(chǔ)[1]。然而最新研究表明，占骨組織 90%～95%的骨細胞才是骨代謝調(diào)節(jié)的“大腦”[2]。骨細胞是位于骨基質(zhì)內(nèi)礦化陷窩的一種高度分化細胞，研究表明，骨細胞不同于位于骨基質(zhì)表面的成骨細胞，其主要任務(wù)不是合成骨基質(zhì)和分泌礦物鹽，而是感受來自體內(nèi)血液及神經(jīng)免疫系統(tǒng)的一系列信號，決定是否啟動骨吸收或骨形成的關(guān)鍵細胞，因而在防治骨質(zhì)疏松等骨代謝性疾病中占有比成骨細胞更重要的位置[3]。本課題組前期研究已證實，黃酮類化合物、超低頻電磁場等都具有促進成骨細胞成熟礦化的能力[4]，對于骨細胞，這些治療方法是否同樣有效，對于骨質(zhì)疏松癥治療新途徑的開發(fā)具有重要意義。然而由于目前可供體外實驗研究的骨細胞系較少，并且有效穩(wěn)定的骨細胞分離方法尚不十分明確[5]。因此，本研究旨在建立完善的從大鼠顱骨中分離純化骨細胞和成骨細胞的方法，并從細胞形態(tài)、堿性磷酸酶(ALP)活性和成骨特異性蛋白的表達等對二者進行比較研究，為今后黃酮類化合物、超低頻電磁場等治療骨質(zhì)疏松癥的機制研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 SPF級新生SD大鼠10只，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級動物實驗中心，許可證號：SCXK(甘) 2004-0006-152；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco， USA)；胎牛血清FBS(HyClone)；新生牛血清CS(PAA)胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)；ALP測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；免疫組化染色試劑盒(北京博奧森)；DAB顯色試劑盒(中杉金橋)；Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)、骨鈣素(BGP)一抗購自abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋公司)；BCA蛋白定量試劑盒；FITC標(biāo)記的免疫熒光二抗(KPL公司)，伊紅、蘇木素(上海源葉公司)。

1.2 儀器 正置熒光顯微鏡(OLYMPUS， Japan),CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Revco，USA),倒置相差顯微鏡(OLYMPUS， Japan),臺式高速冷凍離心機(Heraeus， German),紫外分光光度計(Bio-Rad公司),數(shù)碼凝膠圖像分析儀(bio-Tanon),電泳儀、電轉(zhuǎn)移儀和酶標(biāo)儀均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 成骨細胞的分離培養(yǎng)：將乳鼠置于75%乙醇中浸泡處死，在無菌條件下取其顱骨并去除骨膜及結(jié)締組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.8)清洗3次；將骨片剪碎(大小約1 mm×1 mm×1 mm)，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，0.25%胰酶消化2次(37℃，每次10 min)，棄上清液，0.1%的Ⅱ型膠原酶消化10 min，棄上清；再用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化4次( 37℃,每次20 min)，收集合并上清液，加入5 ml含血清的培養(yǎng)基中止酶消化，150目濾網(wǎng)過濾3次，1000 r/min離心10 min； 棄上清，加入培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基，內(nèi)含10% FBS，青霉素、鏈霉素各100 U/ml)，吹打均勻并計數(shù)。原代細胞懸液以3×105個/ml接種于大皿中培養(yǎng)，每皿10 ml，37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液1次，培養(yǎng)至細胞鋪滿80%皿底后，胰蛋白酶消化傳代(標(biāo)記為P1 代)，此為成骨細胞的分離培養(yǎng)方法。

1.3.2 骨細胞的分離培養(yǎng)：骨細胞的序列消化分離、培養(yǎng)及傳代，主要參考Lee等[6]分離方法，經(jīng)過改進，具體分離、培養(yǎng)和傳代步驟如下：將分離成骨細胞時消化剩余的骨碎片棄去上清液后，PBS清洗骨片3次，用0.02% EDTA溶液(含0.1%的小牛血清白蛋白)第6次消化骨片，棄去上清液，PBS清洗骨片3次。緊接著用0.1%的Ⅰ型膠原酶消化第7次(37℃，每次20 min)，收集上清到新的培養(yǎng)瓶中，并加入5 ml含血清的培養(yǎng)基中止酶消化。交替利用0.02% EDTA溶液和0.1%的Ⅰ型膠原酶化第8次和第9次，收集并合并上清液，每次交替都用PBS溶液清洗骨片3次。將上清150目濾網(wǎng)過濾3次，1000 r/min離心10 min后棄上清，加入培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基，內(nèi)含5%胎牛血清和5%的小牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/ml)，吹打均勻并計數(shù)。原代細胞懸液以3×105個/ml接種于Ⅰ型膠原酶包裹的10 cm大皿中，37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)基，至細胞鋪滿80%皿底后胰蛋白酶消化傳代。

1.3.3 HE染色：將P1代細胞進行爬片培養(yǎng)，3 d后取出爬片并用PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次后用0.1% TritonX-100透膜20 min，PBS漂洗3次。向爬片滴加1 ml蘇木素染液進行初染，10 min后流水沖洗，滴加鹽酸乙醇封化液封化1 s，將爬片立刻放入流水沖洗15 min。再加入1 ml伊紅染液進行復(fù)染，5 min后依次經(jīng)過低濃度到高濃度的乙醇溶液進行脫水，每次2 min，最后將爬片浸泡于二甲苯溶液中2 min后封片。正置熒光顯微鏡進行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.4 Ⅰ型膠原的免疫組化染色：將P1代細胞進行爬片培養(yǎng)，3 d后取出爬片并用PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次后用0.5% Triton-X100透膜20 min，PBS漂洗3次后滴加3% 過氧化氫并37℃孵育15～20 min，已消除內(nèi)源性過氧化物酶。PBS漂洗3次后滴加山羊血清工作液并37℃孵育，15～20 min后傾去勿洗，滴加Ⅰ型膠原抗體(1∶500)并4℃過夜，PBS漂洗3次，每次3 min，之后滴加相應(yīng)的二抗工作液，37℃孵育60 min，PBS漂洗3次每次3 min，最后利用DAB顯色劑進行顯色，流水沖洗后封片，正置熒光顯微鏡觀察兩種細胞的形態(tài)。

1.3.5 骨鈣素(BGP)免疫熒光染色：將P1代細胞進行爬片培養(yǎng)，3 d后取出爬片并用PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次后用0.5% Triton-X100透膜20 min，PBS漂洗3次后滴加山羊血清工作液并37℃孵育，15～20 min后傾去勿洗，滴加BPG抗體(1∶500)并4℃過夜，PBS漂洗3次每次3 min，之后滴加FITC標(biāo)記的免疫熒光二抗并37℃避光孵育。60 min后PBS漂洗3次，每次3 min。封片后置于正置熒光顯微鏡下，488 nm波長的激發(fā)下進行比較觀察。

1.3.6 ALP的偶氮偶合法染色：將P1代細胞進行爬片培養(yǎng)，3 d后取出爬片并用PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛固定30 s，PBS漂洗3次，后轉(zhuǎn)入基質(zhì)液(20 ml，pH=8.9的巴比妥鈉-HCL緩沖液中含α-萘基磷酸鈉和固藍RR鹽各20 mg)中反應(yīng)15 min,當(dāng)出現(xiàn)黃褐色斑點時棄去基質(zhì)液，PBS液沖洗3次后封片，置于正置熒光顯微鏡下進行比較觀察。

1.3.7 ALP活性測定：將兩種原代細胞以5×104個/孔接種于6孔板，每3天更換一次培養(yǎng)基，6 d后測定ALP活性，具體方法如下：棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入緩沖液和基質(zhì)液各0.3 ml混勻，37℃水浴15 min后，加入0.9 ml顯色液，520 nm測定酚標(biāo)準(zhǔn)及樣本吸光值,根據(jù)公式換算為金氏單位。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析：將兩種P1細胞分別以5×104個/ml接種于中皿，3 d后提取總蛋白，利用Western blot檢測骨細胞和成骨細胞中Ⅰ型膠原的表達量。具體方法如下：將貼壁細胞4℃預(yù)冷的PBS漂洗2遍后，加入500 μl的細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl、pH=8.0、150 mmol/L NaCl、100 mg/L PMSF、1 mg/L抑蛋白酶肽、1%吐溫-20、0.5%去氧膽酸鈉、1% SDS)于冰上靜置30 min使細胞充分裂解。4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA法進行總蛋白濃度的測定。95℃變性4 min，各組取含20 μg蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫下?lián)u床振蕩封閉2 h，然后分別加入Ⅰ型膠原一抗(1：1 000稀釋)，4℃過夜。次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1：10 000稀釋) 37℃孵育2 h，每進行下一步實驗前PVDF膜均用4℃預(yù)冷的TBST搖床漂洗4次，每次8 min，用增強化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白，X光片的曝光時間視實驗效果而定，灰度值使用Image-Pro plus 6.0軟件掃描測定。

2 結(jié)果

2.1 成骨細胞與骨細胞的形態(tài)學(xué)結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下成骨細胞形態(tài)多呈梭形或成纖維細胞樣形態(tài)，骨細胞則形態(tài)較豐滿，有多個突觸結(jié)構(gòu)，呈星狀或樹枝狀，細胞間通過突觸互相連接；經(jīng)HE染色后可見成骨細胞和骨細胞在形態(tài)方面存在明顯差別，成骨細胞呈長梭形，而骨細胞因有較多突觸而呈放射狀，細胞間幾乎沒有突觸連接，而骨細胞呈放射狀，并通過大量的樹突結(jié)構(gòu)相互連接，見圖1。

2.2 Ⅰ型膠原免疫組化染色結(jié)果 成骨細胞Ⅰ型膠原表達量較高呈深棕黃色，而骨細胞中Ⅰ型膠原的表達量明顯較低，呈淺棕色，見圖2。

圖1 成骨細胞和骨細胞的形態(tài)學(xué)觀察

A.光學(xué)顯微鏡下成骨細胞(×20)；B.光學(xué)顯微鏡下骨細胞(×20)；C.成骨細胞HE染色(×40)；D.骨細胞HE染色(×40)

圖2 成骨細胞和骨細胞中Ⅰ型膠原免疫組化染色結(jié)果(DAB×40)

A.成骨細胞；B.骨細胞

2.3 BGP免疫熒光染色結(jié)果 BGP在成骨細胞中表達較低，在骨細胞中表達較高，細胞形態(tài)與HE染色結(jié)果相似，見圖3。

2.4 ALP免疫組化染色結(jié)果 ALP免疫組化染色結(jié)果呈棕黃色，由染色結(jié)果可見，成骨細胞的ALP活性顯著高于骨細胞，見圖4，此結(jié)果與Van der Plas等[7]報道相同。

2.5 ALP活性檢測結(jié)果 骨細胞ALP活性低于成骨細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

圖3 成骨細胞和骨細胞中骨鈣素免疫熒光染色結(jié)果(×40)

A.成骨細胞；B.骨細胞

圖4 成骨細胞和骨細胞中堿性磷酸酶免疫組化結(jié)果(偶氮偶合染色×20)

A.成骨細胞；B.骨細胞

2.6 BGP和Ⅰ型膠原定量分析 使用Image-Pro plus 6.0軟件分別對成骨細胞和骨細胞的BGP分泌量和Ⅰ型膠原分泌量灰度值進行掃描測定得知，在骨細胞中BGP相對光密度值明顯高于成骨細胞，而成骨細胞中Ⅰ型膠原的相對光密度值明顯高于骨細胞，見表2。Western blot檢測結(jié)果表明，成骨細胞中BGP表達低于骨細胞，而成骨細胞Ⅰ型膠原表達量高于骨細胞(P<0.01)，見圖5。

表1 成骨細胞與骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶檢測結(jié)果

注：D(λ)520為吸光值；bP<0.01

表2 成骨細胞與骨細胞中骨鈣素與Ⅰ型膠原相對光密度值比較

注：bP<0.01

A B

圖5 成骨細胞和骨細胞中骨鈣素與Ⅰ型膠原蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果

3 討論

骨質(zhì)疏松是一種老年人易發(fā)的疾病，研究表明，外力作用于骨細胞會影響骨組織的形態(tài)及密度，在骨質(zhì)疏松中缺乏機械刺激和骨密度降低密切相關(guān)[8]。成骨細胞作為骨細胞的前體，在骨重建中發(fā)揮著重要作用，多年來對骨代謝的研究多以成骨細胞為基礎(chǔ)[9]，而忽略了對骨細胞的深入研究。目前對于骨細胞研究主要集中于以下幾方面：①骨細胞是礦化骨基質(zhì)中的唯一細胞，其不僅是骨的結(jié)構(gòu)成分，并可作為內(nèi)分泌細胞來調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的活性[10]，調(diào)節(jié)著骨骼的塑形過程。②骨細胞作為力的感應(yīng)細胞，可以感受多種外界機械性信號[11]。③骨細胞是如何將外界機械性信號轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)在化學(xué)信號的，如物理刺激后骨細胞內(nèi)前列腺素(PEG2)、環(huán)腺苷酸(cAMP)和一氧化氮(NO)等含量的改變[12-13]。

在骨骼轉(zhuǎn)化的過程中，由于成骨細胞和破骨細胞的數(shù)量較少且分布在骨組織表面。而骨細胞的數(shù)量占到骨組織細胞數(shù)量的95%，并且在成熟的骨組織內(nèi)。因此骨細胞在時間和空間上會發(fā)出指令決定進行補充哪種細胞，是進行破骨細胞的吸收還是進行成骨細胞的骨形成過程[14]，骨細胞均勻分布在礦化的骨基質(zhì)中并形成了相互交聯(lián)的細胞網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)骨組織受力后會導(dǎo)致骨陷窩-微管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的細胞間質(zhì)液流動，從而對骨細胞產(chǎn)生一種力學(xué)信號[15-16]。近期研究表明骨細胞有傳遞應(yīng)力的作用，因此可以作為外界應(yīng)力的感應(yīng)器。外界流體刺激骨細胞可釋放PEG2，還可產(chǎn)生較高的NO[17-18]，NO具有影響破骨細胞的形成和活性的功能，從而降低骨吸收能力[19]。此外，還有cAMP、類胰島素生長因子1、鈣離子、三磷酸腺苷等也可能會參與。但是目前對于骨細胞受外界刺激產(chǎn)生哪種特異生物化學(xué)信號及骨細胞受力的主要作用機制還不太明確，以及骨細胞是如何將這些力學(xué)刺激在細胞中轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號并傳遞到其他細胞中去的。對于上述問題的研究，需要我們分離出較純的骨細胞。大鼠成骨細胞的分離技術(shù)目前已比較成熟[20]，在此基礎(chǔ)上，本文建了穩(wěn)定地從大鼠顱骨中分離骨細胞和成骨細胞的方法。

成骨細胞向骨細胞成熟礦化的過程中，會伴有一些標(biāo)志性指標(biāo)的改變，這就為我們對骨細胞的研究提供了基礎(chǔ)[21-22]，如ALP是骨形成過程的早期產(chǎn)物，其表達增加說明骨形成處于活躍期，但隨著成骨細胞向骨細胞轉(zhuǎn)變，ALP活性下降。這種標(biāo)志性蛋白還有BGP、Ⅰ型膠原、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1[23]等，本研究利用免疫組化染色、免疫熒光化學(xué)染色和Western blot等方法對這些指標(biāo)進行檢測，結(jié)果表明成骨細胞和骨細胞中ALP、BGP、Ⅰ型膠原的表達存在明顯差異，可以作為今后骨細胞鑒定的成熟指標(biāo)。

前期我們以成骨細胞為研究基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物及電磁場等都能顯著促進成骨細胞的成熟礦化，為抗骨質(zhì)疏松癥新方法的研究做出了貢獻，而骨細胞作為骨代謝的調(diào)控者，為我們對黃酮類化合物以及電磁場的抗骨質(zhì)疏松癥的研究開辟了新途徑。

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Isolation and Identification and Comparative Study of Calvarial Osteoblasts and Osteocytes of Rats

XIE Yan-fang， CHEN Ke-ming, MA Xiao-ni， SHI Wen-gui， ZHOU Jian

(Osteology Institution, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

Objective To discuss methods of isolation and purity of rats' calvarial osteoblasts and osteocytes, and to respectively compare the cellular morphous， the activity of alkaline phosphatase (ALP) and the expression of osteoblast specific protein. Methods Osteoblasts and osteocytes were isolated from skull tissues of neonatal SD rats using sequential collagenase and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) digestion. The cells were identified with hematoxylin and eosin (HE), immunohistochemistry of collagen Ι and immunofluorescence of osteocalcin (BGP) staining. ALP of the two kinds of cells were stained using azo and coupling method, and the activity was detected. Expressions of collagen Ι and BGP of the two kinds of cells were examined by Western blotting. Results The cell morphology after HE staining showed that osteocytes were star-shaped or dendrite-shaped within more dendrites, while osteoblasts were spindle-shaped with less dendrites. Immunohistochemistry staining and Western blotting showed that BGP expression was low in osteoblasts, while the expression was high in osteocytes. The results of fluorescence and HE staining were similar. ALP staining showed that osteoblast had a high expression in osteoblasts, and a low expression in osteocytes. The results of activity detection and staining of ALP were similar. Conclusion The pure calvarial osteocytes and osteoblasts in rats can be isolated by sequential collagenase and EDTA digestion. Osteocytes and osteoblasts may be identified, purified and studied using methods of HE, immunohistochemistry and immunofluorescence staining and Western blotting.

Osteocytes; Osteoblasts; Immunohistochemistry; Collagen Ι; Osteocalcin； Rats， Sprague-Dawley

國家自然科學(xué)基金(81270963，81471090)

730050 蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所

陳克明，E-mail：chenkm@lut.cn

R329.2

A

2095-140X(2015)03-0001-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.001

2014-08-15 修回時間：2014-11-28)