王麗芳 姚一萍 連海飛 張欣昕 李秀萍 曾 杰（內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院資源環(huán)境與檢測技術(shù)研究所，呼和浩特010031）

飼喂黃曲霉毒素B1對奶山羊乳中黃曲霉毒素M1分泌規(guī)律與轉(zhuǎn)化率的影響

王麗芳 姚一萍 連海飛 張欣昕 李秀萍 曾 杰
（內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院資源環(huán)境與檢測技術(shù)研究所，呼和浩特010031）

摘 要：為研究飼糧中添加單一劑量黃曲霉毒素B1（AFB1）后奶山羊乳中黃曲霉毒素M1（AFM1）的分泌規(guī)律及AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1的轉(zhuǎn)化率，選擇3只健康、體重接近的泌乳中期關(guān)中奶山羊，每只羊飼喂1 mg AFB1。飼喂后0、4、8、24、32、48、56、72、80、96、104及120 h采集羊乳，測定AFM1含量。結(jié)果表明：1）飼喂AFB1前（0 h），羊乳中未檢出AFM1，但是飼喂AFB1后4 h，在收集的羊乳中均檢出了AFM1；2）3只試驗在羊乳中AFM1含量存在差異，但是其分泌規(guī)律非常相似，均呈先升高后急劇下降再緩慢下降的趨勢；3）羊乳中AFM1的峰值出現(xiàn)在飼喂AFB1后4～8 h；4）羊乳中AFM1平均含量在56 h時為0.39 μg／kg，低于我國限量值（0.5 μg／kg），到120 h平均含量為0.02 μg／kg，低于歐盟限量值（0.05 μg／kg）；5）各時間點AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1的最大平均轉(zhuǎn)化率為0.19%，出現(xiàn)在4 h；6）飼喂AFB1后24 h內(nèi)的AFM1平均轉(zhuǎn)化率之和占AFM1總轉(zhuǎn)化率的81%。結(jié)果提示，AFM1在奶山羊乳中的排出時間主要集中在采食AFB1后的24 h內(nèi)。

關(guān)鍵詞：奶山羊；黃曲霉毒素B1；羊乳；黃曲霉毒素M1分泌規(guī)律；轉(zhuǎn)化率

黃曲霉毒素B1（AFB1）是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，被聯(lián)合國癌癥委員會確定為一類致癌物［1］。溫暖潮濕氣候的糧食和飼料［2］極易污染AFB1，尤其是谷物、棉籽和花生在收割前后均易污染AFB1［3］。動物攝入AFB1后，在肝臟中通過微粒體細(xì)胞色素P?450轉(zhuǎn)化為黃曲霉毒素M1（AFM1），AFM1也是一種強(qiáng)致癌物，通過血液循環(huán)進(jìn)入到乳中，危害食品安全。因此非常有必要研究飼料中AFB1通過動物機(jī)體代謝轉(zhuǎn)化到乳中AFM1的分泌規(guī)律及轉(zhuǎn)化率，為有效控制飼料中AFB1污染對乳品質(zhì)量安全的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

為了減少人類和動物污染黃曲霉毒素，許多國家對奶畜飼料中AFB1和乳中AFM1均設(shè)置了最大限量值，然而這些限量值在不同國家之間變化范圍比較大。對于飼料，歐盟奶畜全價飼料中AFB1限量值是5 μg／kg［4］，美國動物飼料和奶畜飼料原料中黃曲霉毒素總和的限量值是20 μg／kg［5］，我國奶畜精飼料中AFB1限量值是10 μg／kg。對于乳的限量，歐盟對于液態(tài)乳和乳產(chǎn)品等設(shè)置的限量值是0.05 μg／kg，嬰幼兒用乳中是0.025 μg／kg，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和我國的限量值均是0.5 μg／kg。

對于飼料中AFB1與乳中AFM1的相關(guān)性，已有一些學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究［6－10］，然而這些研究主要是給奶畜飼喂一段時間自然霉變的飼料，探討乳中AFM1的變化。實踐中可能也會發(fā)生只飼喂1次AFB1污染的飼料導(dǎo)致乳中AFM1超過限量值［8］，然而對動物只飼喂1次AFB1污染的飼料導(dǎo)致乳中AFM1變化的研究較少。因此，本試驗通過給奶山羊飼喂一次性單一劑量的AFB1，研究乳中AFM1的分泌規(guī)律及轉(zhuǎn)化率，旨在對實踐中偶然發(fā)生AFB1污染進(jìn)行準(zhǔn)確風(fēng)險分析。

1　材料與方法

1.1 試驗動物和飼養(yǎng)管理

選擇3只健康、體重在（35.00±2.65）kg的泌乳中期［泌乳天數(shù)（150±12）d］關(guān)中奶山羊，產(chǎn)奶量為（0.36±0.03）kg，胎次為2～3胎。試驗羊單籠飼養(yǎng)，每天于08：00和16：00以先粗后精順序分2次飼喂飼糧，飼糧的精粗比是50∶50，精飼料飼喂600 g／（d·只），苜蓿飼喂376 g／（d·只），青干草274 g／（d·只），自由飲水。試驗之前，奶山羊每天擠奶2次，08：30和16：30。

1.2 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧滿足NRC（1981）奶山羊（體重為35 kg）的推薦量，并參照我國奶山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)［11］配制?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗設(shè)計

根據(jù)Battacone等［8，12］的試驗方法，本試驗每只奶山羊飼喂1 mg AFB1，試驗所用AFB1為粉末（純度為99.9%），用甲醇溶解后添加到300 g精飼料中，用于08：00的飼喂，添加后精飼料中AFB1的含量為3 333.3 μg／kg。

在飼喂AFB1后0、4、8、24、32、48、56、72、80、96、104及120 h記錄每只羊的產(chǎn)奶量并采集乳樣，冷凍保存。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 羊乳中AFM1含量

羊乳中AFM1含量的檢測方法參照GB 5413.37—2010，具體步驟如下。

1.4.1.1 試液提取

稱取20.00 g（精確至0.01 g）混勻的乳樣，置于50 mL具塞離心管中，在水浴中加熱到35～37℃。在6 000 r／min下離心10 min。收集全部上清液，供凈化用。

1.4.1.2 凈化

①免疫親和柱的準(zhǔn)備。將一次性的50 mL注射器筒與親和柱上頂部相串聯(lián)，再將親和柱與固相萃取裝置連接起來。

②試樣的純化。將以上試液提取液移至50 mL注射器筒中，調(diào)節(jié)固相萃取裝置的真空系統(tǒng)，控制試樣以2～3 mL／min穩(wěn)定的流速過柱。取下50 mL的注射器筒，裝上10 mL注射器筒。注射器筒內(nèi)加入水，以穩(wěn)定的流速洗柱，然后，抽干親和柱。脫開真空系統(tǒng)，在親和柱下部放入10 mL刻度試管，上部裝上另一個10 mL注射器筒，加入4 mL乙腈，洗脫AFM1，洗脫液收集在刻度試管中，洗脫時間不少于60 s。然后用氮氣緩緩地在30℃下將洗脫液蒸發(fā)至近干（如果蒸發(fā)至干，會損失AFM1），用乙腈水溶液（10%）稀釋至1 mL。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（air?dry basis）　%

1.4.1.3 檢測條件

采用高效液相色譜（HPLC）串聯(lián)質(zhì)譜檢測，儀器設(shè)備型號為waters UPLC／Quattro Premier?XE。

①HPLC條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH?C18，1.7 μm，2.1 mm（內(nèi)徑）×100 mm；流動相：A液，0.1%甲酸溶液，B液，乙腈梯度洗脫；流動相流速：0.3mL／min。柱溫：35℃；進(jìn)樣量：

5 μL；保留時間：3.42 min。

表2　高效液相色譜洗脫條件Table 2 The elution condition for HPLC　%

②質(zhì)譜條件。毛細(xì)管電壓：2.5 kv；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣流：氮氣，600 L／h；脫溶劑氣溫度：450℃；碰撞室壓力：3.0×10－4kPa；掃描方式：正離子模式（ESI＋）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；定量離子：328.88＞258.94，碰撞能量：25 eV；定性離子：328.88＞272.95，碰撞能量：25 eV。

1.4.2 羊乳中AFM1的轉(zhuǎn)化率

AFM1各時間點轉(zhuǎn)化率（%）＝100×AFM1各時間點含量×各時間點產(chǎn)奶量／AFB1添加量；AFM1總轉(zhuǎn)化率（%）＝∑AFM1各時間點轉(zhuǎn)化率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)基本處理采用Excel 2007，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS 9.0進(jìn)行方差分析，平均值的多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1 飼喂AFB1對各試驗羊乳中AFM1分泌規(guī)律的影響

由圖1可知，飼喂AFB1前，3只羊的乳中均未檢出AFM1，但是在飼喂AFB1后4 h收集的羊乳中，3只羊均檢出了AFM1。在1號和2號羊乳中，峰值出現(xiàn)在飼喂AFB1后的4 h，而在3號羊乳中，峰值出現(xiàn)在8 h。在峰值之后，所有羊乳中AFM1含量迅速下降，在120 h時，只有1號羊乳中未檢出AFM1，2號和3號羊乳中仍有微量AFM1檢出。雖然3只羊乳中AFM1分泌曲線相似，即呈先增加后下降趨勢，但是單一曲線在上升過程中差異較大，2號和3號羊乳中AFM1上升幅度比1號羊大。

圖1　飼喂AFB1后各試驗羊乳中AFM1含量的分泌規(guī)律Fig.1 Excretion pattern of AFM1content in milk of experimental goats after fed AFB1

2.2 飼喂AFB1對羊乳中AFM1平均含量的分泌規(guī)律的影響

由圖2可知，飼喂AFB1后，羊乳中AFM1的平均含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在4 h時達(dá)到峰值9.89 μg／kg，接近我國限量值0.5 μg／kg的20倍；在峰值之后，羊乳中AFM1平均含量減少比較快，在56 h時含量為0.39 μg／kg，低于我國限量值，到120 h為0.02 μg／kg，低于歐盟限量值0.05 μg／kg；在4和8 h時，AFM1平均含量顯著高于以后其他各時間點（P＜0.05），24 h時AFM1的平均含量顯著高于56 h及以后其他各時間點（P＜0.05），32 h及以后各時間點之間AFM1平均含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖2　飼喂AFB1后試驗羊乳中AFM1平均含量的分泌規(guī)律Fig.2 Excretion pattern of AFM1average content in milk of experimental goats fed AFB1

2.3 飼喂AFB1對羊乳中AFM1平均轉(zhuǎn)化率的影響

由圖3可知，隨著取樣時間的延長，AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1的平均轉(zhuǎn)化率逐漸降低，到80 h時為0。其中AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1的總轉(zhuǎn)化率為0.53%；飼喂AFB1后4 h時轉(zhuǎn)化率最高為0.19%，8和24 h次之，這3個時間點平均轉(zhuǎn)化率的和為0.43%。

圖3　飼料中AFB1轉(zhuǎn)化為羊乳中AFM1的平均轉(zhuǎn)化率的變化Fig.3 The change of average carry?over rate of AFB1into AFM1in milk of goats

3　討 論

3.1 飼喂AFB1后對試驗羊乳中AFM1含量的分泌規(guī)律的影響

Battacone等［12］報道，給5只奶山羊飼喂單一劑量AFB1后，羊乳中AFM1在上升過程中變化比較大，但5只羊乳中AFM1分泌曲線卻相似，這與本試驗結(jié)果相似。Battacone等［12］給奶山羊飼喂0.8 mg AFB1，在飼喂后3 h時采集乳樣檢出了AFM1；Gallo等［13］給奶牛飼喂4.9 mg的AFB1，飼喂5 min后采血檢出了AFM1；Cook等［14］給肉牛飼喂0.2～0.8 mg／kg BW的混合黃曲霉毒素（AFB1為75%），飼喂后30 min在血液中檢出了AFM1，這些結(jié)果與本試驗結(jié)果相似，表明AFB1在成年反芻動物的胃腸道吸收非?？?，并且它的羥基化合物AFM1也很快分泌到乳中。

Battacone等［12］報道，給奶山羊飼喂單一劑量AFB1后，羊乳中AFM1的峰值在飼喂后3和6 h達(dá)到，為0.6～1.8 μg／kg，這一結(jié)果不同于本試驗結(jié)果4和8 h（5.32～13.47 μg／kg），本試驗AFM1峰值含量是Battacone等［12］試驗結(jié)果的7.5～8.9倍?？赡艿脑蛴蠥FB1不同的喂量、奶山羊的品種、產(chǎn)奶量及體重等。本試驗AFB1的喂量是1 mg，奶山羊為關(guān)中奶山羊，平均產(chǎn)奶量是0.36 kg，平均體重是35 kg，而Battacone等［12］飼喂的量是0.8 mg，奶山羊為薩能奶山羊，平均產(chǎn)奶量是3.35 kg，平均體重是59 kg，但不同飼糧也可能是導(dǎo)致2個試驗峰值A(chǔ)FM1含量不同的原因，本試驗飼喂的飼糧是精飼料、青干草與苜蓿，而Battac?one等［12］飼喂的只是精飼料和干草，不含苜蓿，因此不同飼糧影響AFB1在瘤胃中的降解不同，導(dǎo)致羊乳中AFM1含量也不同。

3.2 飼喂AFB1對羊乳中AFM1平均含量分泌規(guī)律的影響

Battacone等［12］報道，給奶山羊飼喂AFB1后，羊乳中AFM1含量在3和6 h極顯著高于其他時間點，與本試驗結(jié)果AFM1平均含量在4和8 h顯著高于其他各時間點相似。

Battacone等［9］報道，給奶山羊連續(xù)7 d飼喂AFB1［128 μg／（d·只）］，羊乳中AFM1的含量在2～7 d達(dá)到一個穩(wěn)定值，停止飼喂AFB1后，羊乳中AFM1含量迅速下降，在停止飼喂4 d后，羊乳中檢測不到AFM1；Battacone等［12］報道，給奶山羊飼喂1次AFB1（0.8 mg），84 h時檢測不到羊乳中AFM1；本試驗飼喂1次AFB1（1 mg），在飼喂后第5天早晨（120 h）所采集的羊乳中有微量AFM1被檢出（0.02 μg／kg），不同于Battacone等［9，12］的試驗結(jié)果，可能是AFB1飼喂量、飼糧及產(chǎn)奶量不同所致。

Battacone等［12］報道，在飼喂AFB1后36 h收集的羊乳中，AFM1含量低于歐盟限量值0.05 μg／kg；本試驗結(jié)果表明，120 h羊乳中AFM1含量低于歐盟限量值。

3.3 飼喂AFB1對羊乳中AFM1平均轉(zhuǎn)化率的影響

本試驗飼喂AFB1后4、8和24 h 3個時間點AFM1平均轉(zhuǎn)化率之和為0.43%，占AFM1總轉(zhuǎn)化率的81%，暗示了AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1主要在AFB1飼喂后的開始時間，即24 h內(nèi)。Battacone等［8，12］報道AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1的總轉(zhuǎn)化率為0.032%～0.170%，Helferich等［15］報道AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1的總轉(zhuǎn)化率為0.18%～0.38%，Nageswara等［16］報道AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1的總轉(zhuǎn)化率為0.40%，而本試驗結(jié)果表明，AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1的總轉(zhuǎn)化率為0.53%，均高于上述研究結(jié)果，可能是AFB1的飼喂量、不同的飼糧及奶山羊產(chǎn)奶量不同所致。

4　結(jié) 論

①飼喂AFB1前，羊乳中未檢出AFM1，但是飼喂AFB1后4～8 h，羊乳中AFM1含量達(dá)到峰值，在峰值之后AFM1含量減少比較快。

②各時間點AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1的最大平均轉(zhuǎn)化率為0.19%，出現(xiàn)在4 h；飼喂AFB1后24 h內(nèi)的AFM1平均轉(zhuǎn)化率之和占AFM1總轉(zhuǎn)化率的81%。

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Author，WANG Lifang，associate professor，E?mail：wanglifang100008＠163.com

（責(zé)任編輯 王智航）

Excretion Pattern and Carry?Over Rate of Aflatoxin M1in Milk of Dairy Goats after Fed Aflatoxin B1

WANG Lifang YAO Yiping LIAN Haifei ZHANG Xinxin LI Xiuping ZENG Jie
（Institute of Resources Enviroment and Detection Technology，Inner Mongolia Academy of Agriculture and animal husbandry Sciences，Hohhot 010031，China）

Abstract：The aim of this study was to determine the excretion patterns and carry?over rate of aflatoxin M1（AFM1）in milk of dairy goats fed a single dose of aflatoxin B1（AFB1）.Three healthy Guanzhong dairy goats in mid?lactation with similar body weight were administered 1 mg of AFB1.Milk samples were collected after 0，4，8，24，32，48，56，72，80，96，104 and 120 h of AFB1administration to determine AFM1content.The results showed as follows：1）AFM1was not detected in milk before AFB1administration（0 h），but was detected in the first milking following AFB1administration（4 h）；2）the excretion pattern of AFM1content in milk was very similar in all the experimental goats even if the values differed among animals；3）The peak val?ue for AFM1content in milk was observed in milk collected at 4 and 8 h after AFB1administration；4）AFM1average content in milk was 0.39 μg／kg at 56 h and 0.02 μg／kg at 120 h，which moved below the Chinese limit（0.5 μg／kg）and the European Union limit（0.05 μg／kg），respectively；5）the maximum value of aver?age carry?over rate of AFB1into AFM1in milk was 0.19%which appeared at 4 h；6）the sum of average car?ry?over rate at different time point in 24 h was 81%of total average carry?over rate after AFB1administration.In conclusion，AFM1is mostly excreted in milk of dairy goats in 24 h after AFB1administration.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（6）：1915?1920］

Key words：dairy goat；AFB1；goat milk；AFM1excretion pattern；carry?over rate

作者簡介：王麗芳（1975—），女，內(nèi)蒙古托縣人，副研究員，博士，研究方向為生鮮乳質(zhì)量安全研究。E?mail：wanglifang100008＠163.com

基金項目：國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估重大專項（GJFP2014008）；內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新基金項目；內(nèi)蒙古自治區(qū)人才開發(fā)基金項目

收稿日期：2015－01－29

doi：10.3969／j.issn.1006?267x.2015.06.030

中圖分類號：S826

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006?267X（2015）06?1915?06