安亞南 王丹陽 丁立人 楊新崗 鄧亞軍 劉 強(南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,南京210095)
豬胃腸道食糜中黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮檢測方法的改進及其在霉菌毒素吸附劑吸附效果評價中的應(yīng)用
安亞南 王丹陽 丁立人 楊新崗 鄧亞軍 劉 強?
(南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,南京210095)
摘 要:本試驗旨在建立測定豬胃和小腸食糜上清液中黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量的高效液相色譜(HPLC)法,并利用該方法評價霉菌毒素吸附劑分別在不同介質(zhì)中對黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的吸附效果。為消除食糜上清液中復(fù)雜組分對目標毒素檢測的干擾,本試驗對毒素提取方法、液相色譜的檢測波長設(shè)置和流動相組成進行了優(yōu)化。利用單濃度體外吸附試驗評價了4種霉菌毒素吸附劑分別在水、豬胃和小腸食糜上清液介質(zhì)中對黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的吸附效果。結(jié)果表明:1)反應(yīng)上清液經(jīng)過1次正己烷和3次二氯甲烷提取,熒光激發(fā)波長和發(fā)射波長在0~9 min和9~14 min分別設(shè)定為360、440 nm和235、418 nm,乙腈/水流動相中乙腈比例控制在40%~60%時,本試驗采用的HPLC儀對1.00~10 000.00 ng/mL黃曲霉毒素B1和20.00~5 000.00 ng/mL玉米赤霉烯酮具有良好的分離定量效果,線性相關(guān)系數(shù)分別為1.000和0.999;檢出限分別為0.16和2.00 ng/mL;黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮日內(nèi)精密度相對標準差分別為2.37%、4.50%;日間精密度相對標準差分別為2.74%、8.84%。黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮標準添加回收率分別為89.1%~110.3%、98.7%~104.1%。2)自制霉菌毒素吸附劑樣品P3、M3和市場采購的霉菌毒素吸附劑產(chǎn)品Y1、Y2在豬胃食糜上清液介質(zhì)中對黃曲霉毒素B1的吸附率依次為72.10%、84.18%、83.17%和66.01%;在豬小腸食糜上清液介質(zhì)中的吸附率依次為78.15%、88.08%、88.12%和67.34%。4種吸附劑在胃食糜上清液介質(zhì)中對玉米赤霉烯酮的吸附率依次為85.35%、18.41%、16.20%和12.98%;在豬小腸食糜上清液介質(zhì)中的吸附率分別為39.75%、25.15%、21.40%和24.85%。綜上,本試驗建立的HPLC法可同時測定豬胃和小腸食糜上清液中的黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮,檢測限和檢測范圍滿足我國《豬飼料衛(wèi)生標準》的要求。該方法可用于評價霉菌毒素吸附劑豬生理體液條件下對黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的吸附效果。
關(guān)鍵詞:黃曲霉毒素B1;玉米赤霉烯酮;霉菌毒素吸附劑;豬食糜上清液;吸附效果
黃曲霉毒素主要由黃曲霉(Aspegillus flavus)和寄生曲霉(A.parasitius)產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)類似物,其中以黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)毒性最強,檢出率最高[1]。玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是禾谷鐮孢菌(Fusarium gra?minearum)等鐮孢菌產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物。飼料被AFB1和ZEN污染帶來的多種危害及其防治已被廣泛研究[2]。截止目前,添加霉菌毒素吸附劑仍然是降低此類毒素危害常用的方法之一。吸附劑通過物理或化學方式吸附毒素,減少毒素在動物消化道的吸收,使之隨糞便排出體外,從而達到減輕危害的目的[3-7]。由于用動物試驗進行霉菌毒素吸附劑效能評價受到試驗材料、時間和成本等多方面的限制,目前主要采用測定體外吸附率的方法進行快速篩選和評價。常用體外評價方法有純水介質(zhì)中的單一毒素濃度或梯度濃度等溫吸附[6,8]、緩沖液介質(zhì)中的等溫吸附[7,9-10]、模擬胃腸道條件下的吸附[9,11-12]等方法。霉菌毒素的吸附效率受吸附劑材料性質(zhì)、吸附容量、毒素種類和吸附反應(yīng)環(huán)境中其他成分等多種因素影響。飼料成分多樣性及消化道中消化產(chǎn)物和動物內(nèi)源分泌物的復(fù)雜性,進一步增加了建立適用于飼料和畜牧行業(yè)評價霉菌毒素吸附劑吸附效果方法的難度。
本文通過改進已有的AFB1和ZEN檢測方法,建立適用于測定豬胃和小腸食糜上清液相應(yīng)毒素的高效液相色譜(HPLC)法,并分別以純水、豬胃和小腸食糜上清液為介質(zhì)評價2種商用霉菌毒素吸附劑產(chǎn)品和本實驗室自制的2個吸附劑樣品對AFB1和ZEN的體外吸附效率,通過比較4種吸附劑在不同反應(yīng)介質(zhì)中對上述毒素吸附效率的差異,探討影響霉菌毒素吸附的因素,為建立霉菌毒素吸附劑吸附效率評價的新方法奠定基礎(chǔ)。
1.1 試驗材料
1.1.1 儀器
本試驗所用儀器:HPLC儀(HITACHI D-2000,L-2485熒光檢測器)、液相色譜柱(C18,150 mm×4.6 mm,5 μm,島津)、熒光分光光度計(F-7000,日立)、紫外分光光度計(UV-2450,島津)、振蕩恒溫金屬?。˙G-100,杭州朗基)。
1.1.2 試劑
本試驗所用乙腈(Merk,南京榮華)為色譜純,AFB1和ZEN標準品(Sigma公司)。其他試劑均為分析純。
1.1.3 霉菌毒素吸附劑
本實驗室自制霉菌毒素吸附劑樣品:以離子交換量不小于1 000 meq/kg的膨潤土為基質(zhì),分別用長鏈脂肪酸銨鹽和陽離子交換樹脂對基質(zhì)進行表面修飾制成,分別標記為P3和M3樣品。市場采購的霉菌毒素吸附劑產(chǎn)品Y1和Y2,分別為經(jīng)葡聚糖插層改性的膨潤土和經(jīng)甘露聚糖改性的沸石。
1.1.4 豬胃和小腸食糜上清液制備
選用6頭品種相同的育肥豬,出欄前10 d飼喂玉米-豆粕飼糧,屠宰后分別取胃和小腸食糜,3 000 r/min離心10 min,吸取上清液分裝,-20℃保存。
1.1.5 AFB1和ZEN儲備液和標準工作液
標準儲備液:將5.00 mg AFB1標準品溶于10 mL乙腈/苯(體積比為98∶2)溶液中,配制成500 μg/mL的AFB1儲備液。取ZEN標準品10.00 mg溶于10 mL乙腈中,配制成1 000 μg/mL 的ZEN儲備液。
標準工作液:用純水分別稀釋AFB1和ZEN儲備液為約20 μg/mL的標準工作液,紫外分光光度計測定AFB1[εAFB1=21 865 mol/(L·cm),λmax=362 nm]和ZEN[εZEN=13 909 mol/(L·cm),λmax=316 nm]標準工作液的準確含量。
混合標準工作液:分別用AFB1和ZEN標準工作液配制AFB1和ZEN濃度為0和0、2和100 ng/mL、4和400 ng/mL、6和800 ng/mL、10 和1 000 ng/mL、20和1 500 ng/mL、50和5 000 ng/mL的混合標準液。
1.2 豬胃腸道液體介質(zhì)中AFB1和ZEN含量的測定
1.2.1 檢測條件優(yōu)化
檢測波長篩選:采用熒光分光光度計分別對AFB1和ZEN標準溶液的激發(fā)光譜(200~600 nm)和發(fā)射光譜(200~600 nm)進行全波長掃描,選出AFB1和ZEN激發(fā)光譜和發(fā)射光譜中不重疊區(qū)的最大激發(fā)(Ex)和發(fā)射波長(Em)。
流動相優(yōu)化:將乙腈/水流動相中乙腈比例分別設(shè)定為20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%,根據(jù)上述毒素的分離效果和峰形選擇適宜的乙腈比例。
提取條件:取0.5 mL豬胃食糜上清液,加入40 μg/mL的AFB1和ZEN各0.25 mL,2種毒素最終濃度均為10 μg/mL。依次用正己烷萃取1次,二氯甲烷萃取4次,分別收集每次的萃取液,氮氣吹干,固形物用500 μL流動相溶解后用HPLC儀法測定AFB1和ZEN的含量,比較提取溶劑每次的毒素提取效率,計算毒素的總回收率。將二氯甲烷換成氯仿、乙酸乙酯或者石油醚,重復(fù)上述步驟,比較4種提取溶劑的提取效果。將豬胃食糜上清液換成豬小腸食糜上清液,重復(fù)以上步驟,比較豬小腸食糜上清液介質(zhì)下4種提取溶劑對AFB1和ZEN的提取效果。
回收率:分別在豬胃和小腸食糜上清液中加入AFB1和ZEN標準液,使其濃度為0和0 ng/mL,20和500 ng/mL,1.0和2.5 μg/mL,5.0 和10.0 μg/mL,按優(yōu)化后的提取條件提取后,用HPLC測定AFB1和ZEN的回收量,計算其回收率。
1.2.2 檢測方法考察指標
線性和檢測限:分別用AFB1和ZEN混合標準溶液的色譜峰面積(Y)和毒素濃度(X)繪制AFB1和ZEN的標準曲線;以信噪比的3倍所對應(yīng)的毒素濃度作為最低檢測限。
精密度:在上述色譜條件下測定同1天不同時間點(07:00、10:00、12:00、14:00、17:00)和連續(xù)5 d的AFB1和ZEN的濃度,分別計算日內(nèi)精密度和日間精密度。
1.3 吸附劑在純水中對AFB1和ZEN的吸附效果
準確稱取100.0 mg吸附劑于50 mL容量瓶中超純水定容,混合均勻后,量取0.25 mL混合液于1.5 mL離心管中,加入20 μg/mL AFB1標準工作液0.25 mL,37℃金屬浴振蕩1 200 r/min吸附24 h。10 000 r/min離心10 min,HPLC法測定上清液中AFB1含量,計算體外吸附率。按照上述方法測定ZEN的體外吸附率。
1.4 吸附劑在豬胃和腸食糜上清液中對AFB1和ZEN的吸附效果
準確稱取100.0 mg吸附劑于50 mL容量瓶中,分別用豬胃和小腸食糜液上清液定容,混合均勻,取混合液200 μL于1.5 mL離心管中,加入40 μg/mL的AFB1標準溶液和ZEN溶液各100 μL,上述毒素濃度均為10 μg/mL,吸附劑濃度為1 mg/mL,37℃金屬浴1 200 r/min吸附8 h,10 000 r/min離心10 min,根據(jù)1.2中方法測定上清液中AFB1和ZEN濃度,計算吸附劑對AFB1和 ZEN的吸附率。
1.5 結(jié)果計算
吸附劑對AFB1和ZEN吸附率計算公式:
R(%)=[(C0V0-X)/C0V0]×100。
式中:C0為吸附前溶液中毒素濃度(μg/mL);V0為加入毒素標準溶液的體積(mL);X為由標準曲線查出的樣液中毒素含量(μg);R為吸附劑對毒素吸附率(%)。
1.6 統(tǒng)計方法
試驗結(jié)果用平均值±標準差表示,采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件的one?way ANOVA對每種吸附劑在3種介質(zhì)中的吸附率進行方差分析,差異顯著性用Duncan氏法進行多重比較,以P<0.05作為各項差異顯著的檢驗水平。
2.1 霉菌毒素檢測方法條件的篩選
檢測波長:經(jīng)過對AFB1和ZEN激發(fā)和發(fā)射波譜分析,同時參照歐盟的檢測波長[13-14]確定AFB1的最佳激發(fā)和發(fā)射波長分別為360和440 nm,ZEN的最佳激發(fā)和發(fā)射波長分別為235 和418 nm。根據(jù)2種毒素的出峰時間,將0~9 min檢測器的激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)定為360和440 nm以測定AFB1濃度,9~14 min的激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)定為235和418 nm,以測定ZEN濃度。
流動相:乙腈-水流動相中乙腈比例大于40%時,AFB1保留時間過短,不利于AFB1與樣品中雜質(zhì)的分離,小于60%時ZEN峰變寬且有拖尾現(xiàn)象,故采用乙腈比例0~4 min為40%,4~6 min為45%,9~14 min為60%的梯度洗脫。在此條件下可獲得理想的分離效果,標準混合溶液(AFB1和ZEN濃度分別為10和1 000 ng/mL)和樣品色譜圖見圖1。
萃取條件:乙酸乙酯對ZEN、石油醚對AFB1的萃取效率低(數(shù)據(jù)未列出)。正己烷和二氯甲烷組合使用對AFB1和ZEN的提取效果較為理想,結(jié)果如表1,經(jīng)正己烷萃取1次,二氯甲烷萃取2次可以完全提取樣品中的AFB1,經(jīng)1次正己烷和3次二氯甲烷萃取可以完全提取樣品中的ZEN,故試驗采取1次正己烷萃取和3次二氯甲烷萃取。
圖1 混合標準溶液(左)和豬胃腸液中加入混合標準液后(右)AFB1和ZEN的HPLC法色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of AFB1and ZEN in standard solution(left)and that after added in gastrointestinal supernatant of pigs(right)
表1 正己烷和二氯甲烷萃取AFB1和ZEN的回收率Table 1 The recoveries of AFB1and ZEN extracted by n?hexane and dichloromethane %
回收率:在豬胃和小腸食糜上清液中加入已知濃度的2種毒素,經(jīng)優(yōu)化方案提取后,2種毒素的回收率如表2。豬胃食糜上清液中AFB1的回收率為89.8%~110.3%,ZEN為99.3%~102.5%;豬小腸食糜上清液中AFB1的回收率為90.9%~102.9%,ZEN為98.7%~104.0%。
2.2 檢測方法性能指標考察
線性和檢測限:在上述色譜條件下,AFB1濃度在0~50 ng/mL范圍內(nèi)的標準曲線回歸方程為Y=0.000 3X+0.154 9,回歸系數(shù)為1.000,檢出限為0.16 ng/mL;ZEN的濃度在0~5 000 ng/mL之間的回歸方程為Y=0.000 9X-7.005 6,回歸系數(shù)為0.999,檢出限為2.0 ng/mL。
精密度:HPLC法測定同一樣品在同一天中5個時間點的AFB1和ZEN濃度,AFB1濃度的測定值分別為836.00、836.60、833.90、831.50和830.60 ng/mL,其日內(nèi)精密度標準差為2.37%;ZEN濃度的測定值分別為514.20、516.40、523.20、524.90和524.80 ng/mL,其日內(nèi)精密度標準差為4.50%。HPLC法連續(xù)5 d測定同一樣品AFB1和ZEN濃度,AFB1濃度的測定值分別為836.00、835.70、832.40、831.40和828.70 ng/mL,日間精密度標準差為2.74%,ZEN濃度的測定值分別為514.20、490.70、493.20、496.00和490.70 ng/mL,其日間精密度標準差為8.84%。
2.3 不同介質(zhì)中吸附劑對AFB1和ZEN的吸附效果
純水、豬胃和小腸食糜上清液介質(zhì)中4種吸附劑對AFB1的吸附效果如表3所示,吸附率均在60.0%(吸附量6 μg/mL)以上,純水環(huán)境中吸附劑對AFB1的吸附率與豬胃和小腸食糜上清液介質(zhì)中差別較大。純水環(huán)境中,吸附劑Y1和Y2的吸附率顯著低于豬胃和小腸食糜上清液(P<0.05),吸附劑P3的吸附率顯著高于豬胃和小腸食糜上清液(P<0.05),吸附劑M3在純水介質(zhì)中的吸附率與小腸食糜上清液無顯著差異(P>0.05),但顯著高于胃食糜上清液(P<0.05),這與胃腸道復(fù)雜的消化產(chǎn)物和動物內(nèi)源分泌物有關(guān)。除Y2外,小腸食糜上清液介質(zhì)中3種吸附劑對AFB1的吸附率顯著高于胃食糜上清液(P<0.05),這可能是因為胃食糜上清液環(huán)境中高濃度的氫離子(H+)吸附在吸附劑有效吸附位點上,與AFB1形成了競爭效應(yīng)。
表2 AFB1和ZEN在豬胃和小腸食糜上清液中回收率Table 2 The recoveries of AFB1and ZEN from gastric and intestinal chyme supernatant of pigs
表3 不同反應(yīng)介質(zhì)中吸附劑對AFB1的吸附率Table 3 The binding efficacy of AFB1absorption in different media %
4種吸附劑在純水、豬胃和小腸食糜上清液介質(zhì)中對ZEN的吸附效果如表4所示,豬胃和小腸食糜上清液介質(zhì)下吸附劑M3和P3對ZEN的吸附率顯著低于純水介質(zhì)(P<0.05),吸附效果受介質(zhì)環(huán)境的影響較大。除吸附劑P3和Y2外,豬小腸食糜上清液介質(zhì)中吸附劑的吸附率顯著高于胃食糜上清液環(huán)境(P<0.05),這主要是因為酸性環(huán)境下ZEN只以疏水力結(jié)合在吸附劑的表面,中性或堿性環(huán)境下,ZEN陰離子增加了與土層邊緣羥基以靜電作用結(jié)合的吸附位點[10]。對于吸附劑M3和P3,純水環(huán)境中的吸附率顯著高于豬胃和小腸食糜上清液環(huán)境(P<0.05),這可能是復(fù)雜的消化產(chǎn)物或者消化道分泌物與ZEN產(chǎn)生了競爭性吸附作用。
3.1 豬胃腸道食糜上清液中AFB1和ZEN濃度的測定
我國通常采用半定量薄層色譜法(GB/T 8381—2008)和HPLC法(NY/T 1286—2007)測定飼料及飼料原料中AFB1的濃度。其中前者用水和三氯甲烷提取AFB1,以正己烷、乙醚和硅藻土層析柱純化樣品;后者使用甲醇水溶液提取AFB1,以石油醚和三氯甲烷純化樣品。國家標準GB/T 5009.209—2008采用乙腈/水提取谷物中ZEN,再經(jīng)免疫親和柱凈化。此法免疫親和柱凈化所需時間較長,成本較高。本試驗提純豬胃和小腸食糜上清液中AFB1和ZEN時借鑒國家標準測定AFB1的提取純化溶劑,同時參考Krska等[15]提純飼料和谷物中ZEN時采用的乙酸乙酯、乙腈、甲醇和氯仿等有機溶劑和Sprynskyy等[16]提純?nèi)斯の敢褐衂EN的正己烷和二氯甲烷,選取正己烷、氯仿、乙酸乙酯、石油醚和二氯甲烷5種有機溶劑對豬胃和小腸食糜上清液中AFB1和ZEN的提取純化效果進行了探討。結(jié)果顯示,用1次正己烷和3次二氯甲烷萃取后,可完全提取豬胃和腸食糜上清液中的AFB1和ZEN,簡化了國家標準的乙腈/水方法提取ZEN及免疫親和柱純化步驟,大大降低了測定成本。
表4 不同反應(yīng)介質(zhì)下吸附劑對ZEN的吸附率Table 4 The binding efficacy of ZEN absorption in different media %
本試驗參照歐盟測定谷物中黃曲霉毒素和ZEN的方法[13-14],通過熒光分光光度計分別對AFB1和ZEN標準溶液的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜進行全波長掃描,優(yōu)化了檢測器的激發(fā)和發(fā)射波長;通過乙腈/水的梯度洗脫可同時測定豬胃和小腸食糜上清液中AFB1和ZEN濃度。本方法對ZEN的檢出限為2.00 ng/mL,低于國家標準的方法中5 ng/mL的檢出限和歐盟檢測ZEN的3.00~6.00 ng/mL檢出限,其回收率在89.1%~110.3%,符合歐盟對檢測方法回收率在70.0%~110.0%的要求。上述改進后的方法可節(jié)省樣品過免疫親和柱時間,減少工作量和檢測費用,同樣優(yōu)于美國公職分析化學師協(xié)會(AOAC)檢測黃曲霉毒素和ZEN的方法[17-18]。豬胃和小腸食糜上清液不僅含有飼料脂肪和蛋白質(zhì)等的代謝產(chǎn)物,還有消化酶、膽汁酸及其鹽類和脫落的消化道上皮細胞等內(nèi)源物,因此本方法可能也適用于飼料中AFB1和ZEN的檢測。本方法是目前為止較為快速經(jīng)濟的AFB1和ZEN的檢測方法,可以滿足本試驗豬胃和小腸食糜上清液同時測定AFB1和ZEN濃度的需求。
3.2 霉菌毒素吸附劑的評價方法
體內(nèi)試驗雖然可以真實地評價霉菌毒素吸附劑在動物體內(nèi)的效果[19-20],但受到試驗動物的年齡、體重、飼喂階段和飼糧的影響,以及試驗周期長、成本高等的限制,因此體外試驗仍然是評價吸附劑吸附效果的常用方法。純水介質(zhì)條件簡單、易于操作,只適合對吸附劑進行快速的初步篩選。Lemke等[10]研究了不同pH的水溶液中有機蒙脫石對ZEN的吸附效果,結(jié)果表明在不同pH環(huán)境下蒙脫石具有不同的結(jié)合位點和吸附能力。Pim?pukdee等[7]按照Lemke等[10]的方法評價不同pH水溶液中吸附劑NovaSil plus對AFB1的吸附效果,結(jié)果顯示在不同pH環(huán)境下吸附劑對AFB1均有良好吸附效果,并且在動物試驗中能減輕AFB1對肉雞的傷害。由于純水與胃和小腸食糜上清液真實環(huán)境在離子強度等干擾因素方面有明顯差別,D?ll等[21]用不同pH的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液模擬動物胃腸道環(huán)境,用于評價霉菌毒素吸附劑對ZEN和DON的吸附效果。緩沖鹽溶液模擬胃腸道環(huán)境的評價方法可以固定溫度和pH,易于控制試驗條件,但其缺少動物消化道中消化酶等內(nèi)源消化物。Magnoli等[22]比較了純水、不同pH的緩沖液和奶牛瘤胃液環(huán)境下鈉基膨潤土對AFB1的吸附效果,發(fā)現(xiàn)pH相近的純水、緩沖液和瘤胃液環(huán)境吸附劑對AFB1吸附效果呈正相關(guān)的L型等溫吸附曲線。Moschini等[23]分別在純水、低pH和高pH瘤胃液中評價了吸附劑Atox對AFB1的吸附效果并將吸附劑-毒素復(fù)合物投入奶牛瘤胃中,發(fā)現(xiàn)在低pH和高pH瘤胃液介質(zhì)中具有高吸附率的吸附劑Atox同樣可以減少牛奶中AFM1的排出量。本試驗通過比較純水、豬胃和小腸食糜上清液中4種吸附劑對AFB1和ZEN的吸附效率,發(fā)現(xiàn)小腸食糜上清液對ZEN的吸附率顯著高于胃,這與Avantaggiato等[11]在消化酶、胰液和膽汁模擬胃腸道模型中評價消膽胺和活性炭對ZEN的結(jié)果一致;吸附劑P3和M3在豬胃腸道環(huán)境下對AFB1有較好的吸附效果,其添加到飼糧中可能會減輕AFB1對動物的傷害。豬胃腸道環(huán)境中評價吸附劑的吸附效果是一種測定霉菌毒素體外吸附率的可行方法,但該方法在其他動物胃腸道中的適用性還有待進一步研究。在豬胃腸液中吸附效果較好的吸附劑仍需要動物體內(nèi)試驗來驗證真實的吸附效果。
①本試驗建立了同時測定胃和小腸食糜上清液中AFB1和ZEN的HPLC法。
②本方法可用于豬胃和小腸食糜上清液介質(zhì)中評價吸附劑對AFB1和ZEN的體外吸附效率。
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(責任編輯 陳 燕)
Simultaneous Measurement of Aflatoxin B1and Zearalenone in Gastrointestinal Chyme of Pigs and Assessment of Binding Efficacy of Mycotoxin Adsorbents
AN Ya’nan WANG Danyang DING Liren YANG Xingang DENG Yajun LIU Qiang?
(College of Animal Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)
Abstract:This experiment was conducted to develop a high?performance liquid chromatographic(HPLC)method for quantitative determination of aflatoxin B1and zearalenone in supernatant liquor of gastric and intesti?nal of pigs,and the method was used to evaluate binding efficacy of aflatoxin B1and zearalenone by mycotoxin absorbents in different media.In order to eliminate the influence of complex composition in the supernatant,the experiment optimized extraction and purification of the supernatant,detection wavelengths and mobile phases of liquid chromatography.Binding efficacy of 4 mycotoxin adsorbents in a fixed mycotoxin concentration was e?valuated respectively in purified water,the supernatant liquor of gastric and intestinal chyme of pigs.The results showed as follows:1)the supernatant liquor samples were extracted with n?hexane and dichloromethane,the optimal chromatographic condition was that the fluorescent emitted light and excitation light wavelength were set as 360,440 nm within 0 to 9 minutes and 235,418 nm within 9 to 14 minutes,respectively,and the mo?bile phase was the mixture of acetonitrile and water with acetonitrile percentage in the range of 40%to 60%.The analytical method was quantitative determination for aflatoxin B1from 1.00 to 10 000.00 ng/mL and zearalenone from 20.00 to 5 000.00 ng/mL,respectively.The linear correlation coefficient of aflatoxin B1was 1;the limit of detection was 0.16 ng/mL,the intra?day and inter?day precision were 2.37%and 2.74%,with recoveries ranging from 89.1%to 100.3%.The linear correlation coefficient of zearalenone was 0.999;the limit of detection was 2.00 ng/mL,the intra?day and inter?day precision were 4.50%and 8.84%,with recov?ery ranging from 98.7%to 104.1%.2)The adsorption rates of aflatoxin B1on P3,M3,Y1and Y2were 72.10%,84.18%,83.17%and 66.01%from gastric supernatant of pigs,and 78.15%,88.08%,88.12%and 67.34%from intestinal supernatant,respectively.The binding rate of zearalenone on P3,M3,Y1and Y2were 85.35%,18.41%and 16.20%from gastric supernatant of pigs,and 12.98%,39.75%,25.15%,21.40%and 24.85%from intestinal supernatant,respectively.In conclusion,the HPLC method is developed for simultane?ous measurement of aflatoxin B1and zearalenone in supernatant liquor of gastric and intestinal chyme of pigs,and its detection limits and ranges meet the requirement of Hygienical Standard for Feeds in our country.The method is applied to evaluate binding efficacy of mycotoxin adsorbents under the condition of physiological body fluid of pigs.[Chinese Journal of Animal Nutrition,2015,27(6):1823?1831]
Key words:aflatoxin B1;zearalenone;mycotoxin adsorbent;supernatant liquor of chyme of pigs;binding ef?ficacy
Corresponding author?,professor,E?mail:liuayang@njau.edu.cn
通信作者:?劉 強,副教授,碩士生導師,E?mail:liuayang@njau.edu.cn
作者簡介:安亞南(1988—),女,河南開封人,碩士研究生,動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)。E?mail:2012105048@njau.edu.cn
收稿日期:2015-01-23
doi:10.3969/j.issn.1006?267x.2015.06.019
中圖分類號:S816.17
文獻標識碼:A
文章編號:1006?267X(2015)06?1823?09