陶元勇，徐筱林，賈 微，王保強(qiáng)，孫銘艷，趙乃昕

食酸代爾夫特菌16SrRNA檢測(cè)及生物學(xué)特性研究

陶元勇1，徐筱林2，賈 微3，王保強(qiáng)1，孫銘艷1，趙乃昕3

目的 監(jiān)測(cè)食酸代爾夫特菌的生物學(xué)特征、分子生物學(xué)特性及其與感染的關(guān)系。方法 血標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性者，革蘭染色陰性桿菌、球桿菌，進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)特征、細(xì)胞壁化學(xué)成分分析和16SrRNA 基因測(cè)序。結(jié)果 經(jīng)形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征和16SrRNA 基因測(cè)序，鑒定為食酸代爾夫特菌。測(cè)定的1 418 bp序列與此種菌的模式株的序列100%一致，分離菌株與模式株的生化反應(yīng)有一項(xiàng)不同。結(jié)論 本文報(bào)道食酸代爾夫特菌的53種生物學(xué)特性，為常規(guī)生化表型鑒定提供借鑒。

肺纖維化；食酸代爾夫特菌；血培養(yǎng)；16SrRNA基因序列

代爾伏特菌屬為1999年澳大利亞學(xué)者Wen[1]等新建的菌屬，并將以前的食酸叢毛單胞菌重新命名為食酸代爾夫特菌。該菌廣泛分布于自然環(huán)境中，是人類少見(jiàn)的條件致病菌，該菌臨床常規(guī)鑒定比較困難，故臨床報(bào)道較少。作者從一肺炎患者的血液和痰液分離出一株革蘭陰性桿菌，經(jīng)VITEK2 Compact上機(jī)鑒定為罕見(jiàn)羅爾斯頓菌，但仍有一些生化反應(yīng)不符，之后經(jīng)過(guò)16SrRNA檢測(cè)證實(shí)為食酸代爾夫特菌。為此對(duì)食酸代爾夫特菌進(jìn)行了生物學(xué)研究，且與羅爾斯頓菌屬、代爾伏特菌屬生化特性進(jìn)行了比較鑒別，并提出食酸代爾夫特菌的初步表型鑒定思路。結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料：患者徐某，男，83歲，退休干部，2009年11月因肺部感染伴發(fā)熱住院。既往患肺纖維化20余年、糖尿病10余年病史。無(wú)高血壓、結(jié)核病和過(guò)敏史，長(zhǎng)期使用類固醇激素，有30余年吸煙史，每天吸煙20～30支。入院前感冒咳嗽，膿痰，并帶血絲，發(fā)熱最高達(dá)39.6 ℃，氣短，胸悶，胸部不適，畏寒，無(wú)盜汗。查體營(yíng)養(yǎng)良好，意識(shí)清醒，略顯虛弱。皮膚黏膜無(wú)黃染，皮下和黏膜下淋巴結(jié)未觸及腫大。 實(shí)驗(yàn)室檢查：RBC 4.21×1012/L，WBC 13.2×109/L，其中N 85.1%，L 11.5%，M 2.7%，E 0.4%，B 0.3%。PLT 264×109/L。PCT(降鈣素原)2.0 ng/mL，hs-CRP 102.32 mg/L。診斷為肺炎并血流感染，治療用左氧氟沙星和頭孢他啶治療，病情迅速好轉(zhuǎn)并退燒，影像檢查顯示炎癥病灶消退。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定 住院后送檢血培養(yǎng)一套(需氧瓶+厭氧瓶)、痰培養(yǎng)2次。血培養(yǎng)瓶上培養(yǎng)儀后27 h報(bào)陽(yáng)，涂片為革蘭陰性桿菌，隨即一級(jí)報(bào)告，并轉(zhuǎn)種血平板、巧克力平板、MAC平板，35 ℃孵育18～24 h觀察菌落特征并進(jìn)行涂片染色鏡檢，氧化酶試驗(yàn)、OF試驗(yàn)。痰培養(yǎng)接種血平板、巧克力平板、MAC平板。選擇純培養(yǎng)菌落Vitek2 Compact上機(jī)鑒定使用GNI卡和GNS卡，按照儀器SOP文件進(jìn)行操作。

1.3 藥敏試驗(yàn) 采用KB法、上機(jī)MIC法，根據(jù)涂片染色鏡檢以及氧化酶試驗(yàn)、OF試驗(yàn)等結(jié)果選擇抗菌藥物進(jìn)行試驗(yàn)，并判斷結(jié)果。

1.4 細(xì)菌生理生化特性 常規(guī)生理生化試驗(yàn)方法[2-3]，選擇丙酸鹽、D-丙氨酸、甘氨酸、淀粉、明膠、七葉苷、甘油等物質(zhì)為細(xì)菌反應(yīng)底物，觀察該細(xì)菌的生理生化特性，并與羅爾斯頓菌屬細(xì)菌進(jìn)行比較。

1.5 細(xì)菌DNA的提取與純化 采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司試劑盒，從平板上直接挑取細(xì)菌分離株，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 16SrRNA基因測(cè)序 采用文獻(xiàn)[4]通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行16SrRNA基因PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 痰液標(biāo)本直接涂片見(jiàn)到細(xì)胞內(nèi)革蘭染色陰性桿菌。培養(yǎng)18-24 h菌體細(xì)短，有部分菌體稍長(zhǎng)，以短桿菌為主，見(jiàn)圖1-3。

2.2 血平板上培養(yǎng)24 h后，小菌落，扁平光滑。培養(yǎng)48 h，菌落中等大小，圓形、扁平、灰白色、不溶血。在巧克力平板上菌落與以上相似，在麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂上不生長(zhǎng)。30 ℃可生長(zhǎng)，4 ℃不生長(zhǎng)，41 ℃不生長(zhǎng)，在0.5%～1.5%NaCl蛋白胨水生長(zhǎng)，6.5%NaCl蛋白胨水不生長(zhǎng)。

2.3 細(xì)菌生理生化反應(yīng) 觸酶陽(yáng)性、氧化酶陽(yáng)性，不發(fā)酵葡萄糖，符合非發(fā)酵菌特點(diǎn)。Vitek上機(jī)GNI卡鑒定結(jié)果：罕見(jiàn)羅爾斯頓菌。

2.4 16SrRNA基因測(cè)序結(jié)果 登錄NCBI網(wǎng)站，該菌的16SrRNA基因序列經(jīng)BLAST比對(duì)，并與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)做相似性分析。結(jié)果表明，該菌株與已知的食酸代爾夫特菌(Delftiaacidovorans)的16SrRNA基因相似性達(dá)100%，因而該細(xì)菌最終鑒定為食酸代爾夫特菌，登錄號(hào)為NR_024711.1。

2.5 分離菌株與羅爾斯頓菌屬細(xì)菌的部分常用生化反應(yīng)比較鑒別，見(jiàn)表1。

2.6 分離菌株與食酸代爾夫特菌生化反應(yīng)結(jié)果比較，見(jiàn)表2。

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 該菌對(duì)亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星敏感，對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟中介，對(duì)氨曲南、慶大霉素、氨芐西林、阿米卡星耐藥。

圖1 痰涂片細(xì)菌形態(tài)

3 討 論

從生物系統(tǒng)發(fā)育上代爾夫特菌歸屬于rRNA超科III(rRNA superfamily III)變形菌β亞綱，叢毛單胞菌科。1999年澳大利亞學(xué)者Wen等[1]通過(guò)對(duì)叢毛單胞菌科(Comamonadaceac)的細(xì)菌和一些未分類菌株的細(xì)菌的16S rRNA基因測(cè)序分析，將食酸叢毛單胞菌 (Comamonadaceac acidovorans) 從叢毛單胞菌中移出，建立一個(gè)新菌屬-代爾夫特菌屬(Deiftia)。該屬細(xì)菌為革蘭陰性桿菌，氧化酶和觸酶陽(yáng)性，無(wú)芽孢，不產(chǎn)生熒光色素，細(xì)胞內(nèi)積有聚β-羥丁酸鹽[6]，并將食酸叢毛菌命名為食酸代爾夫特菌(D. acidovorans)。食酸代爾夫特菌模式株ATCC15668T于1926年分離于荷蘭代爾夫特市含有豐富乙酰胺的土壤中[1]，故而得名。該菌廣泛存在于自然界中如河水、土壤等，是人類少見(jiàn)的條件致病菌[8]。1976年Weintein報(bào)道了該菌引起留置血壓監(jiān)視器醫(yī)院相關(guān)的菌血癥，1990年Horowitz[7]等首次報(bào)道食酸代爾夫特菌引起心內(nèi)膜炎。該患者為42歲女性，長(zhǎng)期酗酒和10年吸毒史。該菌所致感染國(guó)內(nèi)也有報(bào)道，1998年高向遠(yuǎn)報(bào)道1例食酸代爾夫特菌肺炎，2002年張全華等[9]報(bào)道1例術(shù)后感染所致敗血癥，2011年季寶建[10]等報(bào)道1例84歲女性患者有代爾夫特食酸菌引起肺部感染合并血液感染。食酸代爾夫特菌對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物天然耐藥[11]，本株細(xì)菌對(duì)喹諾酮類、碳青霉烯類以及部分三代頭孢菌素等敏感，對(duì)頭孢曲松和頭孢噻肟中介。因此，對(duì)臨床分離株做準(zhǔn)確鑒定和藥敏試驗(yàn)是合理應(yīng)用抗菌藥物的基礎(chǔ)。食酸代爾夫特菌致病性不強(qiáng)，多引起免疫功能降低者感染，應(yīng)在治療基礎(chǔ)疾病的同時(shí)注意保護(hù)患者的免疫功能免受細(xì)菌侵染。因此，準(zhǔn)確的病原菌診斷對(duì)于臨床抗菌藥物選擇具有重要意義。

表1 分離株與羅爾斯頓菌屬生化特征的比較

表1(續(xù))

表2 分離株與食酸代爾伏特菌生化反應(yīng)比較

Tab.2 Comparison of biochemical reactions of isolated strains andD.acidovorans

特征Characteristic分離株isolatedstrain食酸代爾夫特菌D.acidovoransATCC15668TD.tsuruhatensis[5]菌落色素Colonypigment米色無(wú)色素氧化酶Oxidase+++硝酸鹽還原Nitratereduction+++尿素Urea──+明膠液化Gelatinliquefaction───七葉苷Esculin──Tween80+++DNase──精氨酸雙水解Aagininedehydrolase──+淀粉水解Hydrolysisofstarch───觸酶試驗(yàn)catalyzation+++西蒙枸櫞酸鹽Simoncitrate─ND多粘菌素敏感PolymyxinsensitivesND同化試驗(yàn)AssimilationExperi-ment同化葡萄糖Glucoseassimilation───N-乙酰葡萄糖胺N-acetylglucosea-mine──+L-阿拉伯糖L-Arabiasugar───癸酸鹽DecanoatewND檸檬酸鹽nitratecitrate+ND+苯乙酸鹽Phenylacetate++D-葡萄糖酸鹽D-glucose+NDDL-乳酸鹽DL-lactate++蕈糖Trehalose+ND麥芽糖Maltobiose─ND蔗糖Sucrose──精氨酸Arginine──

表2(續(xù)1)

注：“+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性；v表示未確定；W表示弱陽(yáng)性。d：表示11%～89%菌株陽(yáng)性;v：不同菌株反應(yīng)可變;ND：無(wú)資料;S：敏感.

Note: "+" positive, "-" negative; V not determined; W weakly positive. d: 11%～89% positive; V: different strains of the reaction variable; ND: no data; S: sensitive.

食酸代爾夫特菌不利用葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糖等，生理生化特征復(fù)雜，表型鑒定困難，本文從血液和痰液中分離的純菌株，經(jīng)Vitek自動(dòng)鑒定為罕見(jiàn)羅爾斯頓菌，但經(jīng)生化反應(yīng)復(fù)核驗(yàn)證，有硝酸鹽還原、尿素、觸酶試驗(yàn)等多種重要反應(yīng)結(jié)果不一致。如食酸代爾夫特菌上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)為“+ -+”，而罕見(jiàn)羅爾斯頓菌為“ - + -”，實(shí)驗(yàn)菌株非罕見(jiàn)羅爾斯頓菌得可能性仍較大。后經(jīng)16SrRNA測(cè)序證實(shí)為食酸代爾夫特菌，并對(duì)該菌進(jìn)行53種的生物學(xué)特征研究，其中癸酸鹽、D-丙氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、DL-正亮氨酸、3-羥基丁酸鹽、2,3-丁二醇、甘氨酸、對(duì)羥基苯甲酸鹽、正己酸鹽等22種生化反應(yīng)結(jié)果未見(jiàn)資料報(bào)道，但是本實(shí)驗(yàn)株與食酸代爾夫特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC15668T相比，仍有生化反應(yīng)不一致，如實(shí)驗(yàn)株甘露醇為陰性，而標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽(yáng)性；實(shí)驗(yàn)株菌落有米黃色色素，而標(biāo)準(zhǔn)菌株不產(chǎn)色素等?？赡苁怯捎诘赜虿煌h(huán)境差異所致。近年來(lái)隨著國(guó)家臨床抗菌藥物專項(xiàng)整治活動(dòng)的開(kāi)展和各醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)細(xì)菌耐藥性的重視，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的條件大大改善并相繼配備了各種類型的細(xì)菌全自動(dòng)鑒定和藥敏系統(tǒng)，可鑒定大部分臨床細(xì)菌和藥敏試驗(yàn)。但由于各型儀器的細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)及細(xì)菌生化反應(yīng)模式的局限性，加上同一個(gè)種的細(xì)菌生化特征可能存有不同特點(diǎn)，使一部分細(xì)菌不能鑒定，而且有些鑒定結(jié)果是不正確的。本研究來(lái)自血液和痰液的食酸代爾夫特菌經(jīng)自動(dòng)儀器鑒定出罕見(jiàn)羅爾斯頓菌，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室工作者需要積累經(jīng)驗(yàn)，準(zhǔn)確辨別。

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The 16SrRNA gene and biological characteristics ofDelftiaacidovorans

TAO Yuan-yong1,XU Xiao-lin2,JIA Wei3,WANG Bao-qiang1,SUN Ming-yan1,ZHAO Nai-xin3

(1.WeifangMedicalUniversityHospital,Weifang261031,China;2.ChangleChineseMedicineHospital,Changle262400,China;3.WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

We studied the biological and molecular characteristics ofDelftiaacidovoransand its relationship with infection. Blood samples were cultured positive. By Gram staining, gram negative bacilli and coccobacillus can be observed under microscope. Results showed the morphology, cultural characteristics, 16SrRNA gene sequence, and identification of bacteria forDelftiaacidovorans. Results showed that determination results of 1 418 bp sequence were consistent with this kind of bacteria strain pattern in the sequence of 100%. There was a different biochemical reaction between isolates and type strain. In this paper, we reported the biological properties of 53 types ofDelftiaacidovorans, providing reference for routine identification.

pulmonary fibrosis;Deiftiaacidovorans; blood culture; 16SrRNA gene sequence

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.014

1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，濰坊 261031; Email:taoyanyong@163.com 2.昌樂(lè)中醫(yī)院，昌樂(lè) 262400; 3.濰坊醫(yī)學(xué)院，濰坊 261053

R378

A

1002-2694(2015)08-0751-06

2014-12-29；

2015-03-17