陶元勇，徐筱林，賈 微，王保強，孫銘艷，趙乃昕

食酸代爾夫特菌16SrRNA檢測及生物學特性研究

陶元勇1，徐筱林2，賈 微3，王保強1，孫銘艷1，趙乃昕3

目的 監(jiān)測食酸代爾夫特菌的生物學特征、分子生物學特性及其與感染的關系。方法 血標本培養(yǎng)陽性者，革蘭染色陰性桿菌、球桿菌，進行形態(tài)、培養(yǎng)特征、細胞壁化學成分分析和16SrRNA 基因測序。結果 經(jīng)形態(tài)學、培養(yǎng)特征和16SrRNA 基因測序，鑒定為食酸代爾夫特菌。測定的1 418 bp序列與此種菌的模式株的序列100%一致，分離菌株與模式株的生化反應有一項不同。結論 本文報道食酸代爾夫特菌的53種生物學特性，為常規(guī)生化表型鑒定提供借鑒。

肺纖維化；食酸代爾夫特菌；血培養(yǎng)；16SrRNA基因序列

代爾伏特菌屬為1999年澳大利亞學者Wen[1]等新建的菌屬，并將以前的食酸叢毛單胞菌重新命名為食酸代爾夫特菌。該菌廣泛分布于自然環(huán)境中，是人類少見的條件致病菌，該菌臨床常規(guī)鑒定比較困難，故臨床報道較少。作者從一肺炎患者的血液和痰液分離出一株革蘭陰性桿菌，經(jīng)VITEK2 Compact上機鑒定為罕見羅爾斯頓菌，但仍有一些生化反應不符，之后經(jīng)過16SrRNA檢測證實為食酸代爾夫特菌。為此對食酸代爾夫特菌進行了生物學研究，且與羅爾斯頓菌屬、代爾伏特菌屬生化特性進行了比較鑒別，并提出食酸代爾夫特菌的初步表型鑒定思路。結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料：患者徐某，男，83歲，退休干部，2009年11月因肺部感染伴發(fā)熱住院。既往患肺纖維化20余年、糖尿病10余年病史。無高血壓、結核病和過敏史，長期使用類固醇激素，有30余年吸煙史，每天吸煙20～30支。入院前感冒咳嗽，膿痰，并帶血絲，發(fā)熱最高達39.6 ℃，氣短，胸悶，胸部不適，畏寒，無盜汗。查體營養(yǎng)良好，意識清醒，略顯虛弱。皮膚黏膜無黃染，皮下和黏膜下淋巴結未觸及腫大。 實驗室檢查：RBC 4.21×1012/L，WBC 13.2×109/L，其中N 85.1%，L 11.5%，M 2.7%，E 0.4%，B 0.3%。PLT 264×109/L。PCT(降鈣素原)2.0 ng/mL，hs-CRP 102.32 mg/L。診斷為肺炎并血流感染，治療用左氧氟沙星和頭孢他啶治療，病情迅速好轉并退燒，影像檢查顯示炎癥病灶消退。

1.2 細菌培養(yǎng)與鑒定 住院后送檢血培養(yǎng)一套(需氧瓶+厭氧瓶)、痰培養(yǎng)2次。血培養(yǎng)瓶上培養(yǎng)儀后27 h報陽，涂片為革蘭陰性桿菌，隨即一級報告，并轉種血平板、巧克力平板、MAC平板，35 ℃孵育18～24 h觀察菌落特征并進行涂片染色鏡檢，氧化酶試驗、OF試驗。痰培養(yǎng)接種血平板、巧克力平板、MAC平板。選擇純培養(yǎng)菌落Vitek2 Compact上機鑒定使用GNI卡和GNS卡，按照儀器SOP文件進行操作。

1.3 藥敏試驗 采用KB法、上機MIC法，根據(jù)涂片染色鏡檢以及氧化酶試驗、OF試驗等結果選擇抗菌藥物進行試驗，并判斷結果。

1.4 細菌生理生化特性 常規(guī)生理生化試驗方法[2-3]，選擇丙酸鹽、D-丙氨酸、甘氨酸、淀粉、明膠、七葉苷、甘油等物質(zhì)為細菌反應底物，觀察該細菌的生理生化特性，并與羅爾斯頓菌屬細菌進行比較。

1.5 細菌DNA的提取與純化 采用上海生工生物工程技術服務有限公司試劑盒，從平板上直接挑取細菌分離株，按說明書進行操作。

1.6 16SrRNA基因測序 采用文獻[4]通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行16SrRNA基因PCR擴增，產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程技術有限公司進行DNA測序。

2 結 果

2.1 痰液標本直接涂片見到細胞內(nèi)革蘭染色陰性桿菌。培養(yǎng)18-24 h菌體細短，有部分菌體稍長，以短桿菌為主，見圖1-3。

2.2 血平板上培養(yǎng)24 h后，小菌落，扁平光滑。培養(yǎng)48 h，菌落中等大小，圓形、扁平、灰白色、不溶血。在巧克力平板上菌落與以上相似，在麥康凱瓊脂、營養(yǎng)瓊脂上不生長。30 ℃可生長，4 ℃不生長，41 ℃不生長，在0.5%～1.5%NaCl蛋白胨水生長，6.5%NaCl蛋白胨水不生長。

2.3 細菌生理生化反應 觸酶陽性、氧化酶陽性，不發(fā)酵葡萄糖，符合非發(fā)酵菌特點。Vitek上機GNI卡鑒定結果：罕見羅爾斯頓菌。

2.4 16SrRNA基因測序結果 登錄NCBI網(wǎng)站，該菌的16SrRNA基因序列經(jīng)BLAST比對，并與GenBank 數(shù)據(jù)庫做相似性分析。結果表明，該菌株與已知的食酸代爾夫特菌(Delftiaacidovorans)的16SrRNA基因相似性達100%，因而該細菌最終鑒定為食酸代爾夫特菌，登錄號為NR_024711.1。

2.5 分離菌株與羅爾斯頓菌屬細菌的部分常用生化反應比較鑒別，見表1。

2.6 分離菌株與食酸代爾夫特菌生化反應結果比較，見表2。

2.7 藥敏試驗結果 該菌對亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星敏感，對頭孢曲松、頭孢噻肟中介，對氨曲南、慶大霉素、氨芐西林、阿米卡星耐藥。

圖1 痰涂片細菌形態(tài)

3 討 論

從生物系統(tǒng)發(fā)育上代爾夫特菌歸屬于rRNA超科III(rRNA superfamily III)變形菌β亞綱，叢毛單胞菌科。1999年澳大利亞學者Wen等[1]通過對叢毛單胞菌科(Comamonadaceac)的細菌和一些未分類菌株的細菌的16S rRNA基因測序分析，將食酸叢毛單胞菌 (Comamonadaceac acidovorans) 從叢毛單胞菌中移出，建立一個新菌屬-代爾夫特菌屬(Deiftia)。該屬細菌為革蘭陰性桿菌，氧化酶和觸酶陽性，無芽孢，不產(chǎn)生熒光色素，細胞內(nèi)積有聚β-羥丁酸鹽[6]，并將食酸叢毛菌命名為食酸代爾夫特菌(D. acidovorans)。食酸代爾夫特菌模式株ATCC15668T于1926年分離于荷蘭代爾夫特市含有豐富乙酰胺的土壤中[1]，故而得名。該菌廣泛存在于自然界中如河水、土壤等，是人類少見的條件致病菌[8]。1976年Weintein報道了該菌引起留置血壓監(jiān)視器醫(yī)院相關的菌血癥，1990年Horowitz[7]等首次報道食酸代爾夫特菌引起心內(nèi)膜炎。該患者為42歲女性，長期酗酒和10年吸毒史。該菌所致感染國內(nèi)也有報道，1998年高向遠報道1例食酸代爾夫特菌肺炎，2002年張全華等[9]報道1例術后感染所致敗血癥，2011年季寶建[10]等報道1例84歲女性患者有代爾夫特食酸菌引起肺部感染合并血液感染。食酸代爾夫特菌對氨基糖苷類抗菌藥物天然耐藥[11]，本株細菌對喹諾酮類、碳青霉烯類以及部分三代頭孢菌素等敏感，對頭孢曲松和頭孢噻肟中介。因此，對臨床分離株做準確鑒定和藥敏試驗是合理應用抗菌藥物的基礎。食酸代爾夫特菌致病性不強，多引起免疫功能降低者感染，應在治療基礎疾病的同時注意保護患者的免疫功能免受細菌侵染。因此，準確的病原菌診斷對于臨床抗菌藥物選擇具有重要意義。

表1 分離株與羅爾斯頓菌屬生化特征的比較

表1(續(xù))

表2 分離株與食酸代爾伏特菌生化反應比較

Tab.2 Comparison of biochemical reactions of isolated strains andD.acidovorans

特征Characteristic分離株isolatedstrain食酸代爾夫特菌D.acidovoransATCC15668TD.tsuruhatensis[5]菌落色素Colonypigment米色無色素氧化酶Oxidase+++硝酸鹽還原Nitratereduction+++尿素Urea──+明膠液化Gelatinliquefaction───七葉苷Esculin──Tween80+++DNase──精氨酸雙水解Aagininedehydrolase──+淀粉水解Hydrolysisofstarch───觸酶試驗catalyzation+++西蒙枸櫞酸鹽Simoncitrate─ND多粘菌素敏感PolymyxinsensitivesND同化試驗AssimilationExperi-ment同化葡萄糖Glucoseassimilation───N-乙酰葡萄糖胺N-acetylglucosea-mine──+L-阿拉伯糖L-Arabiasugar───癸酸鹽DecanoatewND檸檬酸鹽nitratecitrate+ND+苯乙酸鹽Phenylacetate++D-葡萄糖酸鹽D-glucose+NDDL-乳酸鹽DL-lactate++蕈糖Trehalose+ND麥芽糖Maltobiose─ND蔗糖Sucrose──精氨酸Arginine──

表2(續(xù)1)

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性；v表示未確定；W表示弱陽性。d：表示11%～89%菌株陽性;v：不同菌株反應可變;ND：無資料;S：敏感.

Note: "+" positive, "-" negative; V not determined; W weakly positive. d: 11%～89% positive; V: different strains of the reaction variable; ND: no data; S: sensitive.

食酸代爾夫特菌不利用葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糖等，生理生化特征復雜，表型鑒定困難，本文從血液和痰液中分離的純菌株，經(jīng)Vitek自動鑒定為罕見羅爾斯頓菌，但經(jīng)生化反應復核驗證，有硝酸鹽還原、尿素、觸酶試驗等多種重要反應結果不一致。如食酸代爾夫特菌上述三個實驗為“+ -+”，而罕見羅爾斯頓菌為“ - + -”，實驗菌株非罕見羅爾斯頓菌得可能性仍較大。后經(jīng)16SrRNA測序證實為食酸代爾夫特菌，并對該菌進行53種的生物學特征研究，其中癸酸鹽、D-丙氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、DL-正亮氨酸、3-羥基丁酸鹽、2,3-丁二醇、甘氨酸、對羥基苯甲酸鹽、正己酸鹽等22種生化反應結果未見資料報道，但是本實驗株與食酸代爾夫特菌標準菌株ATCC15668T相比，仍有生化反應不一致，如實驗株甘露醇為陰性，而標準菌株為陽性；實驗株菌落有米黃色色素，而標準菌株不產(chǎn)色素等?？赡苁怯捎诘赜虿煌h(huán)境差異所致。近年來隨著國家臨床抗菌藥物專項整治活動的開展和各醫(yī)療機構對細菌耐藥性的重視，臨床微生物實驗室的條件大大改善并相繼配備了各種類型的細菌全自動鑒定和藥敏系統(tǒng)，可鑒定大部分臨床細菌和藥敏試驗。但由于各型儀器的細菌數(shù)據(jù)庫及細菌生化反應模式的局限性，加上同一個種的細菌生化特征可能存有不同特點，使一部分細菌不能鑒定，而且有些鑒定結果是不正確的。本研究來自血液和痰液的食酸代爾夫特菌經(jīng)自動儀器鑒定出罕見羅爾斯頓菌，說明實驗室工作者需要積累經(jīng)驗，準確辨別。

[1]Wen A, Fegan M, Hayward C, et al. Phylogenetic relationships among members of the Comamonadaceae, and description ofDelftiaacidovorans(den Dooren de Jong 1926 and Tamaoka et al. 1987) gen. nov., comb. nov[J]. Int J Syst Bacteriol, 1999, 49(2): 567-576. DOI:10.1099/00207713-49-2-567

[2]Dong XZ, Cai MY. Common bacterial system identification manual[M]. Beijing: Science Press, 2001:163. (in Chinese) 東秀珠, 蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京: 科學出版社, 2001:163.

[3]Zhou DQ. Microbiology course[M]. 2nd ed.Beijing: Higher Education Press, 2002：82-149. (in Chinese) 周德慶.微生物學教程[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社：2002:82-149.

[4]Moreno C, Romero J, Espejo RT. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genusVibrio[J]. Microbiology, 2002, 148(4): 1233-1239.

[5]Shigematsu T, Yumihara K, Ueda Y, et al.Delftiatsuruhatensissp.nov. a terephthalate-assimilating bacterium isolated from activated sludge[J]. Int J Syst Evol, Microbiol, 2003, 53(5): 1479-1483. DOI:10.1099/ijs.0.02285-0

[6]Zhao NX, Yuan GY. Medical bacterial name and classification[M]. 3rd ed. Jinan: Shandong UP, 2013: 143. (in Chinese) 趙乃昕, 苑廣盈.醫(yī)學細菌名稱及分類鑒定[M]. 3版. 濟南: 山東大學出版社, 2013: 143.

[7]Horowitz H, Gilroy S, Feinstein S, et al. Endocarditis associated withComamonasacidovorans[J]. J Clin Miceobiol, 1990, 28(1): 143-145. DOI:0095-1137/90/010143-03$02.00/0

[8]Li JZ, Liu LP. The reaserch progress ofDeiftia[J]. China Trop Med, 2008, 8(12): 2254-2255. (in Chinese) 李金鐘, 劉利平.代夫特菌屬的研究進展[J].中國熱帶醫(yī)學, 2008, 8(12): 2254-2255.

[9]Zhang QH, Lei DG. A case report of septicemia caused byComamonasacidovorans[J]. Acta Academiae Medicinae Tertiae, 2002, 24(10): 1255. (in Chinese) 張全華, 雷殿剛. 食酸叢毛單胞菌致敗血癥1例[J].第三軍醫(yī)大學學報, 2002, 24(10): 1255.

[10]Ji BJ, Cao DS, Yu XH. A case report of pulmonary infection and blood infection caused byDelftiaacidovorans[J].China Prac Med, 2011, 6(10): 189. (in Chinese) 季寶建, 曹德生, 于小匯.代爾夫特食酸菌引起肺部感染合并血液感染1例[J].中國實用醫(yī)藥, 2011, 6(10): 189.

[11]Murab PB, Barm EJQ, Pfaller MA, et al. Acinetobacter, Alcaligenes, Moraxeua, and other nonfermentative gram-negative[J]. Bacteria Manual Clin Microbiol, 1995, (4): 520-532.

The 16SrRNA gene and biological characteristics ofDelftiaacidovorans

TAO Yuan-yong1,XU Xiao-lin2,JIA Wei3,WANG Bao-qiang1,SUN Ming-yan1,ZHAO Nai-xin3

(1.WeifangMedicalUniversityHospital,Weifang261031,China;2.ChangleChineseMedicineHospital,Changle262400,China;3.WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

We studied the biological and molecular characteristics ofDelftiaacidovoransand its relationship with infection. Blood samples were cultured positive. By Gram staining, gram negative bacilli and coccobacillus can be observed under microscope. Results showed the morphology, cultural characteristics, 16SrRNA gene sequence, and identification of bacteria forDelftiaacidovorans. Results showed that determination results of 1 418 bp sequence were consistent with this kind of bacteria strain pattern in the sequence of 100%. There was a different biochemical reaction between isolates and type strain. In this paper, we reported the biological properties of 53 types ofDelftiaacidovorans, providing reference for routine identification.

pulmonary fibrosis;Deiftiaacidovorans; blood culture; 16SrRNA gene sequence

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.014

1.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，濰坊 261031; Email:taoyanyong@163.com 2.昌樂中醫(yī)院，昌樂 262400; 3.濰坊醫(yī)學院，濰坊 261053

R378

A

1002-2694(2015)08-0751-06

2014-12-29；

2015-03-17