努爾買買提，滿 莉，溫亞梅，肖洪興

(1.伊犁師范學(xué)院新疆維吾爾自治區(qū)教育廳普通高等學(xué)校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 伊寧 835000；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024；3.四平市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站，吉林 四平 136000)

野生杏遺傳多樣性研究

努爾買買提1，滿 莉2，溫亞梅3，肖洪興2

(1.伊犁師范學(xué)院新疆維吾爾自治區(qū)教育廳普通高等學(xué)校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 伊寧 835000；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024；3.四平市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站，吉林 四平 136000)

采用DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)原產(chǎn)于我國新疆伊犁河谷地區(qū)的杏(ArmenicavulgarisLamarck)進(jìn)行了群體樣本測(cè)序.對(duì)所獲得的野生杏單拷貝核基因Adh1序列進(jìn)行了分析.結(jié)果表明：不同野杏居群的核苷酸多態(tài)性和單倍型多態(tài)性沒有顯著差異.Gapdh基因序列的分析顯示，各野生杏居群的核苷酸多態(tài)性和單倍型多態(tài)性相對(duì)較低，特別是鞏留縣核桃溝的野生杏居群，其核苷酸多態(tài)性和單倍型多態(tài)性均為0.此外，AMOVA分析結(jié)果表明，遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)，而居群之間沒有明顯的遺傳分化.研究結(jié)果不僅揭示了野生杏居群的遺傳多樣性，而且為杏的遺傳資源研究保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù).

野生杏；遺傳多樣性；SNP

杏(ArmenicavulgarisLamarck)，薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)杏屬(Armeniaca)落葉喬木，我國各地均產(chǎn)，多數(shù)為栽培；華北、西北和華東地區(qū)種植較多，少數(shù)地區(qū)逸為野生，新疆各地均有栽培.杏原產(chǎn)中國新疆，在新疆伊犁一帶野生成為純林或與新疆野蘋果林混生.野生杏主要分布于在伊犁的北天山等區(qū)域，西起于霍城縣的大西溝、小西溝、果子溝，伊寧縣的匹里青溝和吉里格朗溝，并向東延伸至新源縣的鐵木爾勒克.[1]上述區(qū)域的南向山溝和山脈的西坡、東坡，由于陽光充足、雨水充沛，非常有利于野杏的生長(zhǎng).從垂直分布來看，新疆野杏主要分布在闊葉林帶的下半部，海拔950～1 400 m的低山帶山坡和河谷中.

野生杏具有抗寒、抗旱、耐貧瘠、適應(yīng)性強(qiáng)、栽培容易等特點(diǎn)，是綠化荒山、保護(hù)農(nóng)田、實(shí)行果糧間作的優(yōu)良樹種.其果實(shí)的形狀、顏色、品質(zhì)及抗旱特性，都比栽培杏具有更為豐富的遺傳多樣性.因此，加強(qiáng)對(duì)野生杏資源的搜集、保存與利用，對(duì)于擴(kuò)大栽培杏的遺傳多樣性具有重要意義.

近年來，國內(nèi)外關(guān)于杏種質(zhì)資源的研究越來越多，于希志等[2]對(duì)新疆杏資源進(jìn)行了系統(tǒng)考察，揭示了新疆杏的資源特點(diǎn)；王磊等[1]從分布區(qū)域、形態(tài)生理、生長(zhǎng)特性等方面描述了新疆杏的多樣性；劉黎明等[3]對(duì)新疆野生杏生殖生態(tài)進(jìn)行了初步的研究；呂英民等[4]應(yīng)用同工酶進(jìn)行了杏屬植物演化關(guān)系和分類的研究.同時(shí)，也有部分學(xué)者采用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)新疆野生杏的遺傳多樣性進(jìn)行了探討，如何天明等[5]利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)對(duì)伊犁河谷野生杏種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析.然而，以往對(duì)新疆野生杏遺傳多樣性的研究大多采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)[6]、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)[7]、 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (amplified restriction fragment polymorphism，AFLP)等分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記由于所攜帶的遺傳信息較少，有的穩(wěn)定性不強(qiáng)，近年來逐漸開始被淘汰.

隨著基因組測(cè)序研究的發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)已成為生命科學(xué)中的研究熱點(diǎn).它是繼RAPD和SSR等第一、二代分子標(biāo)記技術(shù)之后的最新的一代分子標(biāo)記，因其在基因組中分布廣泛、位點(diǎn)豐富、遺傳穩(wěn)定、易實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、分子標(biāo)記輔助育種、品種鑒定和種質(zhì)資源管理的研究中.目前，在玉米(ZeamayL.)、大豆(Glycinemax)、小麥(TriticumaestivumL.)及其他植物物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的SNP.[8]然而，利用SNP分子標(biāo)記對(duì)新疆野生杏的遺傳多樣性進(jìn)行研究的報(bào)道較少.因此，本研究采用以PCR和DNA測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的SNP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)野生杏的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究，以期為野生杏資源的有效保護(hù)和科學(xué)利用提供一些理論支持，同時(shí)也為進(jìn)一步開展新疆野杏的遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料的收集與基因組DNA提取

研究材料采集于新疆伊犁河谷地區(qū)伊寧縣的阿吾贊、鞏留縣的核桃溝和霍城縣的大西溝(見圖1和表1).采用快捷型植物基因組提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京)提取新疆野生杏的基因組DNA，具體步驟參考產(chǎn)品說明書.

圖1 樣品采集分布圖

表1 新疆野生杏居群的采樣地點(diǎn)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI(National Center for Biotechnology Information)中公布的擬南芥的乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，Adh1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh)的基因序列與杏屬的EST文庫進(jìn)行比對(duì)，獲得杏屬的Adh1和Gapdh基因的EST序列.基于所獲得序列(Adh1基因序列號(hào)為CV046978，Gapdh基因序列號(hào)為CV044191)利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(見表2).

表2 引物信息

實(shí)驗(yàn)所用的PCR反應(yīng)體系包括：10×Buffer(Mg2+plus)2.0 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.4 μL，正反引物(10 pmol/μL)均為0.5 μL，rTaq酶(1 U/μL) 0.2 μL，模板基因組DNA(50 ng/μL)2 μL，ddH2O 14.4 μL.擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min.4℃保存.擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.2.2 PCR產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化與測(cè)序

將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后連接到pMD18-T載體(Takara)上，再將連接了目的片段的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)JM109(Takara)內(nèi)，置于無氨芐的LB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)2 min；將菌液均勻涂在含有氨芐(AMP)的LB固體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)12 min.挑取透明的單一菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè).反應(yīng)體系15 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min.4℃保存.選擇檢測(cè)為陽性菌落的菌液送到上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序.

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)測(cè)序所獲得的數(shù)據(jù)，采用序列比對(duì)軟件Clustalx1.81[9]對(duì)Gapdh和Adh1基因進(jìn)行序列的比對(duì)，然后利用Bioedit[10]編輯軟件進(jìn)行人工調(diào)整和編輯.

遺傳多樣性分析主要采用DnaSP5.0[11]軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，具體參數(shù)包括核苷酸多態(tài)性(Pi)、單倍型多態(tài)性(Hd)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(s)和單倍型數(shù)目(h).同時(shí)，采用DnaSP5.0軟件對(duì)Gapdh和Adh1基因進(jìn)行Tajima’sD分析.此外，采用Arlequin 3.1[12]軟件中的AMOVA分析遺傳變異在野杏居群中的分布情況，并根據(jù)Fst來探討群體間的遺傳分化程度.

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性檢測(cè)

我們對(duì)野生杏3個(gè)居群總共53個(gè)個(gè)體的Gapdh和Adh1基因進(jìn)行了測(cè)序，一共獲得53條Gapdh基因序列；因?yàn)橛行﹤€(gè)體在Adh1基因序列上有不同拷貝，所以共有68條Adh1基因序列(見表3).其中，Adh1基因片段的長(zhǎng)度大約在900 bp，與實(shí)驗(yàn)中根據(jù)杏屬序列設(shè)計(jì)的引物所對(duì)應(yīng)的片段長(zhǎng)度相符.基于Adh1基因序列分析，野生杏居群的核苷酸多態(tài)性(Pi)較高，其范圍在0.024～0.025之間.此外，不同野生杏居群間的核苷酸多態(tài)性沒有明顯的差異.而基于Gapdh基因序列分析結(jié)果，野生杏居群的核苷酸多態(tài)性(Pi)較低，其范圍在0.000～0.003之間，其中鞏留居群序列核苷酸多態(tài)性為0.

Adh1基因序列的單倍型多態(tài)性(Hd)分析顯示，霍城縣大西溝野生杏居群的單倍型多態(tài)性最高(0.995)，其次是伊寧縣阿吾贊野生杏居群(0.989)，最低的是鞏留縣核桃溝野生杏居群(0.988).該結(jié)果與各居群的核苷酸多態(tài)性一致.Gapdh基因序列分析顯示，伊寧縣阿吾贊野生杏居群的單倍型多態(tài)性最高(0.988)，霍城縣大西溝野生杏居群次之，Hd值為0.702；鞏留縣核桃溝野生杏居群最小，單倍型多態(tài)性是0.000.結(jié)合核苷酸多態(tài)性和單倍型多態(tài)性可以看出，伊寧縣阿吾贊野生杏居群和霍城縣大西溝野生杏居群的遺傳多樣性較高，鞏留縣核桃溝野生杏居群的遺傳多樣性低于這兩個(gè)居群.此外，通過對(duì)比2個(gè)基因的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Adh1的核苷酸多態(tài)性和單倍型多態(tài)性都要明顯高于Gapdh基因(見表3).

表3 野生杏居群的遺傳多樣性

2.2 中性檢驗(yàn)與AMOVA分析

Tajima’sD是用于檢驗(yàn)分子進(jìn)化過程中中性學(xué)說的一個(gè)統(tǒng)計(jì)參數(shù).從物種水平上對(duì)野生杏居群的Adh1基因和Gapdh基因序列進(jìn)行中性檢驗(yàn)，結(jié)果(見表3)顯示，Adh1基因序列的Tajima’s D值不顯著(P>0.10)，說明該基因并未受到自然選擇.與此類似，Gapdh基因序列的分析結(jié)果顯示，除了鞏留縣核桃溝的野生杏居群外，另外2個(gè)居群的Tajima’sD為負(fù)值.負(fù)的D值表明含有比理論上更多的低頻率的突變位點(diǎn)[13].

此外，通過對(duì)這2個(gè)基因進(jìn)行的AMOVA分子方差分析表明，遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)，居群間變異很小(Adh1基因FST=-0.031 42，Gapdh基因FST=0.070 38)(見表4)，這說明這3個(gè)群體的遺傳分化較低.

表4 基于Adh1和Gapdh基因序列的分子變異分析

3 討論

3.1 野生杏群體的遺傳多樣性

原產(chǎn)新疆的杏是我國重要的野生果樹之一，因此已有眾多的學(xué)者對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行了探討.何天明等[5]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)伊犁河谷野生杏種群的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)野生杏種群保持較高的遺傳多樣性(多態(tài)性帶百分率P=82.4%，Shannon多樣性指數(shù)為0.428)；此外，苑兆和等[14]利用熒光AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)普通杏4個(gè)生態(tài)群(伊犁生態(tài)群、中亞生態(tài)群、歐洲生態(tài)群、華北生態(tài)群)的群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明伊犁生態(tài)群(野生杏)具有較高的遺傳多樣性(P=43.59%，H=0.131，I=0.202).本研究基于SNP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)野生杏的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明這3個(gè)野生杏居群的Adh1基因具有較高的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性.相對(duì)而言，Gapdh基因的分析結(jié)果卻顯示，這3個(gè)野生杏居群的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性較低.

3.2 野生杏群體的遺傳變異

根據(jù)AMOVA分子方差分析，野生杏群體的遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)，居群間的遺傳變異很小.導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因可能有2個(gè)：首先，各個(gè)居群間可能存在較大的基因流，從而阻止了居群之間的分化.已有的對(duì)野生杏的研究結(jié)果表明，野生杏居群間的遺傳距離與居群間的地理分布間隔具有相關(guān)性，這說明了地理距離相近的群體之間存在基因流.[5]其次，這些居群可能是最近才分化的.圖1顯示，霍城縣、鞏留縣分別位于新疆伊犁自治州的西北部和東南部，阿吾贊位于伊寧縣境內(nèi)，處于中部，這種地理分布對(duì)野生杏的遺傳分化有著顯著的影響.

3.3 野生杏遺傳多樣性資源保護(hù)

高水平的遺傳多樣性是種群穩(wěn)定的基礎(chǔ).本研究中的野生杏居群保持了較高的遺傳多樣性，因此，對(duì)這些自然群體的保護(hù)是對(duì)野生杏種質(zhì)資源保護(hù)的首要任務(wù).此外，還可以考慮建立保護(hù)基地，建立核心種質(zhì)基因庫，通過人工授粉等措施促進(jìn)基因交流，最大限度地保持野生杏種群的遺傳多樣性.在進(jìn)行遺傳多樣性保護(hù)和種質(zhì)資源保存的同時(shí)，應(yīng)充分重視居群內(nèi)不同類型個(gè)體的保存，同時(shí)也要在分布區(qū)不同區(qū)域內(nèi)保存不同的群體.[15]

[1] 王磊.新疆野蘋果和新疆野杏[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989(6):33-34.

[2] 于希志，廖新宇，張加延.新疆杏的資源特點(diǎn)與開發(fā)利用前景[J].落葉果樹，1998(增刊):60-62.

[3] 劉黎明.新疆野杏生殖生態(tài)初步研究[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[4] 呂英民，呂增仁，高鎖柱.應(yīng)用同工酶進(jìn)行杏屬植物演化關(guān)系和分類的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1994，9(4):69-74.

[5] 何天明，陳學(xué)森，徐正，等.利用SSR標(biāo)記對(duì)伊犁河谷野杏種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析[C].中國園藝學(xué)會(huì)第十屆會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集，2005.

[6] HORMAZA J I. Molecular characterization and similarity relationships among apricot (PrunusarmeniacaL.)genotypes using simple sequence repeats[J].Theor Appl Genet，2002，104:321-328.

[7] MARILYN L WARBURTON，F(xiàn)REDRICK A BLISS.Genetic diversity in peach (PrunuspersicaL.Batch) revealed by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers and compared to inbreeding coefficients[J].J AMER SOC HORT SCI，1996，121(6):1012-1019.

[8] 鄒洪鋒.野生、半野生和栽培大豆的單核苷酸多態(tài)性[D].南昌:南昌大學(xué)，2005.

[9] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al.The CLUSTAL_X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Research，1997，25:4876-4882.

[10] AHMED MANSOUR ALZOHAIRY.Bioedit：an important software for molecular biology[J].GERF Bulletin of Biosciences，2011(2):60-61.

[11] LIBRADO P，ROZAS J.DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J].Bioinformatics，2009，25(11):1451-1452.

[12] EXCOFFIER L，LAVAL G，SCHNEIDER S.Arlequin3.0：an integrated software package for population genetics data analysis[D].Switzerland:Institute of Zoology，University of Berne，2006.

[13] ADA CHING，KATHERINE S CALDWELL，MARK JUNG，et al. SNP frequency，haplotype structure and linkage disequilibrium in elite maize inbred lines[J].BMC Genetics，2002(3):1-14.

[14] 苑兆和，陳學(xué)森，張春雨，等.普通杏群體遺傳結(jié)構(gòu)的熒光AFLP分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2008(3):319-328.

[15] 李飛飛，崔大方，廖文波，等.中國新疆野蘋果(Malussieversii(Ldb.) Roem.)種群地理分布格局及其遺傳關(guān)系研究[J].干旱區(qū)地理，2011，34(6):926-932.

(責(zé)任編輯：方 林)

Genetic diversity of wild apricot (PrunusarmeniacaL.) in Xinjiang

NU ER Mai-mai-ti1，MAN Li2，WEN Ya-mei3，XIAO Hong-xing2

(1.Key Laboratory at Universities of Education Department of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Yili Normal College，Yining 835000，China；2.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China；3.Environmental Monitoring Station of Siping City，Siping，136000，China)

This study employed DNA sequencing technique to investigate the genetic diversity of three natural populations (AWZ，GONGLIU and HUOCHENG) of wild apricots (PrunusarmeniacaL.) distributing in Yili Valley，Xinjiang.According to the resulted sequences of Adh1 gene，the genetic population analyses showed that three natural populations of wild apricot possessed high levels of nucleotide and haplotype diversity.In contrast，the results of Gapdh revealed that relatively low nucleotide and haplotype diversity were found in the three populations.Specifically，no SNPs were identified in the population in GONGLIU.In addition，the analysis of AMOVA demonstrated that no significantly genetic differentiations were observed between the three populations.The findings provided framework for future studies of genetic conservation of wild apricots.

wild apricot；genetic diversity；SNP

1000-1832(2015)04-0111-05

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2015.04.024

2014-04-02

自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(2014915)；新疆教育廳普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2013YSHXYB08).

努爾買買提(1971—)，男，博士研究生，講師；通訊作者：肖洪興(1963—)，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事植物系統(tǒng)與進(jìn)化研究.

Q 941+.2 [學(xué)科代碼] 180·5155

A