鄒圣強(qiáng)，潘 鑫，魏 超，蘇兆亮，王一鏜

大鼠下肢擠壓傷模型不同擠壓時(shí)間的生化指標(biāo)觀察

鄒圣強(qiáng)1，2，潘 鑫1，魏 超1，蘇兆亮1，王一鏜3

目的 探討不同擠壓時(shí)間后大鼠相關(guān)生化指標(biāo)的變化。方法 2月齡健康SD大鼠48只，體重160～200 g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=40)和對(duì)照組(n=8)。其中實(shí)驗(yàn)組分為擠壓4、6、12、24、48 h等5組，每組各8只大鼠。預(yù)定擠壓時(shí)間到達(dá)解除負(fù)重后4 h觀察大鼠雙下肢改變，眼眶采血行血生化檢測(cè)。結(jié)果 擠壓期間實(shí)驗(yàn)組共7只大鼠死亡，解除壓迫后，存活大鼠雙下肢腫脹明顯，不能正?；顒?dòng)；實(shí)驗(yàn)組大鼠血清的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase， AST)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而肌酐(creatinine,Cr)、K+水平實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 不同擠壓時(shí)間對(duì)大鼠的生化指標(biāo)有不同影響。

擠壓傷； 再灌注； 大鼠模型

擠壓傷(crush injury)包括擠壓綜合征、筋膜間室綜合征和急性外傷性缺血，會(huì)引起出血、水腫及低灌注導(dǎo)致的局部低氧和缺血[1]。擠壓傷在人群踩踏事件的傷員中常見(jiàn)，廣義指機(jī)體任何一個(gè)部位受到擠壓，使組織結(jié)構(gòu)的連續(xù)性受到破壞和功能障礙。但是臨床上所提的擠壓傷特指人體肌肉豐富的部位，如四肢、軀干，受壓榨或擠壓后所造成的損傷。通常受壓肌肉組織大量變性、壞死，組織間隙滲出、水腫。表現(xiàn)為受壓部位的腫脹，感覺(jué)遲鈍或喪失，運(yùn)動(dòng)障礙，以及肌紅蛋白血癥和一過(guò)性肌紅蛋白尿。與此相關(guān)的另一個(gè)概念就是擠壓綜合征(crush syndrome, CS)，通常指?jìng)麊T肢體被長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)擠壓后，肢體發(fā)生創(chuàng)傷性橫紋肌溶解，當(dāng)擠壓解除后傷員出現(xiàn)以肢體腫脹、肌紅蛋白尿、高血鉀、急性腎衰竭為主要臨床表現(xiàn)的一系列癥狀。

近年因地震、車禍等意外事件發(fā)生頻繁，出現(xiàn)擠壓傷-擠壓綜合征的傷員也呈逐步增多趨勢(shì)，并保持著較高的發(fā)病率和病死率[2-5]。目前，日益增多的高層建筑倒塌和突發(fā)群體性踩踏事件，也是擠壓傷發(fā)生率增至40%的原因之一[6]，導(dǎo)致的病死傷員中發(fā)生擠壓綜合征的占20%[7]。在2008年汶川發(fā)生的8級(jí)大地震中，共有6.9萬(wàn)人遇難,受傷37.4萬(wàn)人,其中95%的傷亡是源于建筑物坍塌引起的砸傷和擠壓傷[8]。因此擠壓傷-CS成為災(zāi)害醫(yī)學(xué)救援及臨床研究的熱點(diǎn)課題。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠雙下肢擠壓傷后不同時(shí)間生化指標(biāo)的變化，為擠壓傷的診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡健康SD大鼠48只，雌雄不限，體重160～200 g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2013-0011]。飼養(yǎng)環(huán)境：保持環(huán)境清潔，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度適宜，通風(fēng)良好。每8只大鼠飼養(yǎng)于1個(gè)大籠中，自由進(jìn)食飲水。

1.2 大鼠雙下肢擠壓傷模具 采用由四川成都東成機(jī)械有限公司生產(chǎn)的大鼠雙下肢擠壓傷模具。此模具由動(dòng)物固定臺(tái)、連接柱、固定柱、承重板等組成。動(dòng)物固定臺(tái)長(zhǎng)40 cm、寬20 cm、高2 cm。固定臺(tái)中部開(kāi)有2排孔，每排各6個(gè)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大小放置U形固定架。固定臺(tái)底邊裝有3 cm可拆卸固定柱。承重板由不透明硬質(zhì)塑料板制成，長(zhǎng)20.0 cm、寬17.8 cm、高0.6 cm，兩邊開(kāi)有大小為11.5 cm×1.2 cm的條形槽，方便放置金屬柱螺桿(高 10 cm)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 Beckman Coulter AU5800全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；5417R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；奧林巴斯BX53顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；鉀離子測(cè)定試劑盒(Beckman Coulter 配套AU生化分析系統(tǒng)專業(yè)電解質(zhì)參比液)；ALT測(cè)定試劑盒、AST測(cè)定試劑盒、CK測(cè)定試劑盒(浙江夸克生物科技有限公司)；Cr測(cè)定試劑盒(上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)；BUN檢測(cè)試劑盒(寧波美康生物科技股份有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法及分組 本實(shí)驗(yàn)主要建立SD大鼠擠壓傷-CS動(dòng)物模型。將SD大鼠48只隨機(jī)(隨機(jī)數(shù)字法)分為實(shí)驗(yàn)組(40例)和對(duì)照組(8例)。以俯臥位將實(shí)驗(yàn)組大鼠放置于固定臺(tái)U形固定架內(nèi)，待壓雙下肢后伸平放，以細(xì)繩寬松栓住雙足后將雙后肢拉伸置于固定臺(tái)后方中間的條形槽內(nèi)，鼠尾置于最中心的條形槽；將承重板插入金屬柱螺桿后，配加10 kg重[9]金屬砝碼(圖1)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠不給予進(jìn)食、飲水，不作麻醉，身體前部和雙前肢可自由活動(dòng)。預(yù)定擠壓時(shí)間到達(dá)后解除壓迫。對(duì)照組大鼠不作處理，作為正常對(duì)照。

圖1 大鼠擠壓傷模型

1.5 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.5.1 大體觀察 觀察實(shí)驗(yàn)組大鼠存活情況，于擠壓4、6、12、24、48 h 各取8只大鼠，觀察大鼠雙下肢活動(dòng)情況，并通過(guò)排泄孔觀察血尿發(fā)生情況。

1.5.2 血生化檢測(cè) 大體觀察后，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組大鼠于解除壓迫后4 h在不作麻醉下直接用長(zhǎng)頸(3～4 cm)硬質(zhì)玻璃滴管(毛細(xì)管內(nèi)徑0.5～1.0 mm)在大鼠眼內(nèi)眥處旋轉(zhuǎn)插進(jìn)，通過(guò)眼眶靜脈叢采血約2～3 ml，以2000 r/min離心機(jī)離心20 min，吸出上層血清，檢測(cè)反映肝功能的AST和ALT，反映腎功能的BUN、Cr、K+以及反映心肌損傷的CK。對(duì)照組同法采血檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 實(shí)驗(yàn)組共40只大鼠，擠壓期間共7只大鼠死亡，其中擠壓后12 h死亡1只，擠壓24 h死亡2只，擠壓48 h死亡4只。解除壓迫后，存活大鼠雙下肢腫脹明顯，不能正?；顒?dòng)。解剖肌肉組織可見(jiàn)肌肉水腫，顏色變蒼白，隨著擠壓時(shí)間推移肌肉顏色逐漸呈暗紅色，并有淡紅色液體滲出。實(shí)驗(yàn)組擠壓4 h大鼠無(wú)血尿發(fā)生，6、12、24、48 h分別有2只(25.0%)、3只(37.5%)、3只(37.5%)、5只(62.5%)發(fā)生血尿(含死亡大鼠)。

2.2 血生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組在4、6、24、48 h 各時(shí)間點(diǎn)亞組的ALT、AST均顯著高于對(duì)照組(均P>0.05)；在4、24、48 h各亞組的BUN，以及24、48 h亞組的CK均顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)；Cr、K+組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。不同時(shí)間點(diǎn)之間比較的結(jié)果見(jiàn)表1。

指標(biāo)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組4h6h12h24h48hFPALT(U/L)43．65±10．13168．33±20．14②149．75±22．50②111．27±46．06229．97±135．93①271．23±89．76①5．5750．004AST(U/L)101．25±13．18750．23±175．26①765．22±119．25①597．17±334．41②1046．20±560．73①1143．95±264．60①6．7480．002BUN(mg/dl)7．03±1．6524．20±9．98②18．31±3．9414．57±3．5431．73±18．54①25．79±4．49①3．9380．018Cr(μmol/L)33．60±6．2644．70±15．1036．20±4．7531．80±3．8372．80±43．4936．78±5．162．4500．082K+(mmol/L)6．02±0．776．39±0．685．77±0．416．26±0．776．11±0．395．94±0．980．3410．880CK(U/L)624．13±246．516515．97±389．17①5822．5±3394．09①1024．47±1054．094256．97±2917．503351．55±1486．243．8420．019

注：不同擠壓時(shí)間與對(duì)照組的檢測(cè)指標(biāo)對(duì)比，①P<0.01；②P<0.05

3 討 論

本課題大鼠擠壓傷動(dòng)物模型，主要以10 kg擠壓重量，分別擠壓4、6、12、24、48 h 5個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)后解壓，并在解除壓迫后分別觀察SD 大鼠生理、生化變化，選擇指標(biāo)為常見(jiàn)的AST、ALT、CK、BUN等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)指標(biāo)均明顯升高，擠壓部位的肌肉組織有的缺血損傷，符合擠壓傷動(dòng)物模型特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，擠壓4、12 h組的血鉀高于對(duì)照組，同時(shí)還高于擠壓24 h和48 h組，說(shuō)明血K+升高不宜作為診斷擠壓傷的指標(biāo)，它可能只是擠壓傷后急性死亡的原因之一。

擠壓傷多見(jiàn)于四肢，以雙下肢為代表的橫紋肌肌肉組織分布較豐富，因此本實(shí)驗(yàn)以10 kg重物擠壓雙下肢制作擠壓傷模型。目前文獻(xiàn)報(bào)道的擠壓傷數(shù)據(jù)大多來(lái)自地震導(dǎo)致的傷員，其中又以4～6 h擠壓解除時(shí)間為主[10]，因此，考慮到大鼠與人類的差異及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)模擬的相似度，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定解除壓迫后4 h作為實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)。與其他研究擠壓傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究不同[11]，本實(shí)驗(yàn)在擠壓大鼠時(shí)不給予進(jìn)食、飲水，目標(biāo)是模擬踩踏事件的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際情況。

實(shí)驗(yàn)組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)解壓后，其受壓的雙下肢均出現(xiàn)了明顯腫脹，但此時(shí)測(cè)量腫脹周徑各組間并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明不同擠壓時(shí)間造成大鼠肢體的損傷，但壓迫時(shí)間是否對(duì)擠壓傷進(jìn)程的速度有影響，尚需進(jìn)一步觀察和實(shí)驗(yàn)。隨著擠壓時(shí)間的延長(zhǎng)，ALT、AST檢測(cè)指標(biāo)逐漸升高，說(shuō)明肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激過(guò)程中降解肌肉分解產(chǎn)物的負(fù)擔(dān)逐步加重，導(dǎo)致肝臟功能損傷。實(shí)驗(yàn)組的血生化檢測(cè)結(jié)果也顯示，隨著擠壓時(shí)間延長(zhǎng)而較對(duì)照組有不同程度增加，實(shí)驗(yàn)組中不同擠壓時(shí)間組的ALT、AST、K+、BUN、Cr、CK 等指標(biāo)均較對(duì)照組有明顯升高，但每項(xiàng)指標(biāo)并沒(méi)有體現(xiàn)出擠壓時(shí)間越長(zhǎng)，指標(biāo)改變?cè)矫黠@的特點(diǎn)。反映心臟損傷的CK高峰值出現(xiàn)在擠壓4 h組，反映腎臟損傷的K+、BUN 和 Cr 分別于擠壓4、24 和 24 h 達(dá)高峰，反映肝臟損傷的ALT和AST高峰都出現(xiàn)在擠壓48 h組，說(shuō)明隨著擠壓時(shí)間延長(zhǎng)，肌肉分解產(chǎn)物的毒性對(duì)心臟、腎臟、肝臟的損傷作用具有序貫性和時(shí)間依賴性，可能與擠壓傷的發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。而在擠壓48 h組中Cr、K+、CK等檢測(cè)指標(biāo)均有大幅降低，是否具有特殊意義或與采血過(guò)程中負(fù)壓產(chǎn)生溶血有關(guān)，尚需要進(jìn)一步深入研究。

在本實(shí)驗(yàn)中，擠壓12 h的平均測(cè)量值均較6 h的值降低(除K+)，但24 h時(shí)平均測(cè)量值又升高且大于6 h，筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)尚未發(fā)現(xiàn)類似報(bào)道，因此考慮存在以下可能性。一是本實(shí)驗(yàn)設(shè)定解除壓迫后4 h作為實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)，與文獻(xiàn)[11]采用解除壓迫后3 h作為實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)不同，這可能是本文與其部分生化指標(biāo)有差異的原因；二是與大鼠在擠壓12 h后的機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，是否與經(jīng)歷了一定時(shí)間的擠壓后機(jī)體自我修復(fù)能力適應(yīng)性增強(qiáng)有關(guān)；三是同大鼠的選擇有關(guān)，雖然選擇了同一批次，體重上無(wú)差異的大鼠進(jìn)行隨機(jī)分配，但難以避免大鼠的生理機(jī)能出現(xiàn)不同程度的差異，造成實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)差異。以上均為推測(cè)，尚有待以后的實(shí)驗(yàn)中尋找明確的答案。

綜上所述，受單一重量(10 kg)擠壓的SD大鼠擠壓時(shí)間4 h及以上，均出現(xiàn)雙下肢明顯腫脹，受壓肌肉壞死，BUN、Cr、ALT、AST、K+、CK 等血生化指標(biāo)升高，說(shuō)明生化發(fā)生不同程度改變。據(jù)此，由于現(xiàn)場(chǎng)傷員隨時(shí)會(huì)發(fā)生變化，只要傷員未得到最終的醫(yī)療救治，就必須不斷對(duì)傷員進(jìn)行檢傷分類[12]。有專家研究認(rèn)為，踩踏事故中，主要有撞擊、擠壓和碾挫等致傷方式[8]，由于本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮O(shè)計(jì)為單一致傷因素，所以在今后的研究中應(yīng)該增加撞擊、碾挫等復(fù)合致傷因子，以使實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ透淤N近災(zāi)害現(xiàn)場(chǎng)擠壓傷的綜合情況，以便為臨床救治提供更全面的科學(xué)依據(jù)。

志謝：感謝江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊慧建和萬(wàn)曉蕾碩士對(duì)實(shí)驗(yàn)研究所做的工作和相關(guān)幫助。

[1] Gregory R C. 災(zāi)害救援醫(yī)學(xué)[M]. 鄭靜晨，彭碧波，譯.北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2014:913-915.

[2] Phalkey R, Reinhardt J D, Marx M. Injury epidemiology after the 2001 Gujarat earthquake in India: a retrospective analysis of injuries treated at a rural hospital in the Kutch district immediately after the disaster [J]. Glob Health Action, 2011(4):7196-7204.

[3] Alavi-Moghaddam M, Safari S, Najafi I,etal. Accuracy of urine dipstick in the detection of patients at risk for crush-induced rhabdomyolysis and acute kidney injury [J]. Eur J Emerg Med, 2012,19(5):329-332.

[4] He Q, Wang F, Li G,etal. Crush syndrome and acute kidney injury in the Wenchuan earthquake [J]. J Trauma, 2011,70(5):1213-1217.

[5] Vanholder R, Borniche D, Claus S,etal. When the earth trembles in the Americas: the experience of Haiti and Chile 2010 [J]. Nephron Clin Parct, 2011,117(3):c184-c197.

[6] Better O S, Rubinstein I. Management of shock and acute renal failure in casualties suffering from the crush syndrome [J]. Ren Fail,1997,19(5):647-653.

[7] Liang N J, Shih Y T, Shih F Y,etal. Disaster epidemiology and medical response in the Chi-Chi earthquake in Taiwan[J]. Ann Emerg Med,2001,38(5):549-555.

[8] 王一鏜, 劉中民. 災(zāi)難醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2013:483-486.

[9] Akimau P, Yoshiya K, Hosotsubo H,etal. New experimental model of crush injury of the hindlimbs in rats [J].J Trauma, 2005, 58(1): 51-58.

[10] Dhar D, Varghese T P. Crush syndrome case report and literature review [J]. Macedonian Journal of Medical Sciences, 2010, 3(3): 319-323.

[11] 陳 曦，劉躍洪，徐 巍，等. 簡(jiǎn)易大鼠擠壓傷-擠壓綜合征模型建立的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2013,27(1)：77-82.

[12] 王東明，鄭靜晨，李向暉. 災(zāi)害醫(yī)學(xué)救援中的檢傷分類[J].中華災(zāi)害救援醫(yī)學(xué)，2014,2(4)：186-190.

(2015-01-12收稿 2015-02-01修回)

(責(zé)任編輯 郭 曉)

Biochemical observation in the different time of lower limbs crush injury in rats model

ZOUShengqiang1，2,PANXin1,WEIChao1,SUZhaoliang1,andWANGYitang3.

1.DepartmentofDisasterandEmergencyMedicine,ClinicalMedicalCollege,JiangsuUniversity,Zhenjiang212005,China；2.ZhenjiangThirdHospitalAffiliatedtoJiangsuUniversity,Zhenjiang212005,China; 3.DepartmentofEmergency,NanjingUniversity,Nanjing210029,ChinaCorrespondingauthor:PANXin,E-mail:jjzxywk@126.com

Objective To explore the biochemical changes of rats crushed with different time. Methods A total of 48 Sprague Dawley rats (2-month-old, male or female, weighing 160～200 g) were randomly divided into the control group (n=8) and experimental group (n=40). The experimental group was divided into 5 groups according to the crushing time, e.g. 4 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, with 8 rats in each group. The changes in the both lower limbs of rats were observed 4 hours after every treatment time, meanwhile, orbital blood of rats were collected for blood biochemical detection. Results 7 rats died during compressing, and obvious swelling were observed after removing loads among lower limbs of all survivals, as well as activity limitation. Compared with control group, the serum level of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), urea nitrogen (BUN), creatine kinase (CK) in experimental groups were significantly higher than those in control group, all with a statistically significant difference (P<0.05), whereas the serum level of creatinine (Cr), K+showed no significant difference between experimental and control group (P>0.05). Conclusions Different crushing time has different effect on biochemical index of rats.

crush injury; reperfusion; rats model

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.02.004

江蘇省鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展科技支撐項(xiàng)目(SH2013097)

鄒圣強(qiáng)，碩士，教授，E-mail:1210xyz@163.com

1.212005 鎮(zhèn)江,江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院災(zāi)難與急救醫(yī)學(xué)系； 2.212005，江蘇大學(xué)附屬鎮(zhèn)江三院 3. 210029，南京醫(yī)科大學(xué)急診醫(yī)學(xué)系

潘 鑫，E-mail:jjzxywk@126.com

R846.1