王春風(fēng)，孫 敏，吳占敖，吳曉亮，姜 濤

0 引 言

自骨整合理論的提出，鈦金屬就以無可比擬的優(yōu)點(diǎn)成為最普遍和最廣泛運(yùn)用的口腔種植體基質(zhì)材料［1］，但應(yīng)用中也存在不足［2－3］。因此，對鈦及鈦合金表面進(jìn)行改性處理，提高其生物活性是一種很有發(fā)展前景的研究工作［4］，得到材料界和醫(yī)學(xué)界的普遍重視。

研究表明鈦表面原始鈍化態(tài)氧化膜中引入鈣離子，使其轉(zhuǎn)化為活性氧化膜，明顯增強(qiáng)鈦的生物活性，而鈣離子存在形式是鈦酸鈣(Calcium titanate，CaTiO3)［5－6］。還有研究顯示，含鈣離子的鈦氧化物層能提高鈦植入體的骨結(jié)合能力［7－8］，CaTiO3具有潛在的生物活性，且具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性［9－11］。本研究通過水熱合成方法在純鈦表面制備CaTiO3涂層，評價其生物學(xué)性能和安全性能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD 大鼠12 只，選擇出生24 h 內(nèi)的胎鼠，雌雄不限。清潔級ICR 小鼠64 只(江蘇大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重18 ～20 g，7 ～12 周齡，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SYXK(蘇)2008-0024。新西蘭大白兔普通級1 只(南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體重2 ～3 kg，實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SCXK(蘇)2002-0031。飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫22 ～23 ℃，濕度50%～60%，光照周期12 h。標(biāo)準(zhǔn)飲食，不限飲水。實(shí)驗(yàn)前在飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)生活7 d，每天密切關(guān)注動物的狀態(tài)。

1.2 主要試劑與儀器 TA2 鈦板(西北有色金屬研究所產(chǎn)品)、鈦酸四丁酯［(C4H9O)4Ti］、氧化鈣(CaO，上?；瘜W(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)、DMEM 培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Gibco 公司產(chǎn)品)、DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司產(chǎn)品)、JSM 掃描電子顯微鏡(Scanning electronic microscopy，SEM，日本JEOL 公司產(chǎn)品)、X 射線粉末衍射儀(X-ray diffraction，XRD，日本理學(xué)株式會社Rigaku 產(chǎn)品)、精密電子天平(日本AND 會社產(chǎn)品)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司產(chǎn)品)、能譜分析儀(Energy dispersive spectrometer，EDS，美國Thermo Scientific 公司產(chǎn)品)。

1.3 方法

1.3.1 鈦表面CaTiO3涂層的制備及表面形狀分析①將純鈦片(約8 mm×8 mm×1 mm)，經(jīng)過打磨、拋光、噴砂和真空預(yù)氧化處理后，再分別用丙酮，無水乙醇，去離子水超聲洗滌烘干待用。鈦片的制備及預(yù)處理在江蘇大學(xué)化工學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所完成。②將2.5 mL(C4H9O)4Ti 與7.5mL 正丁醇室溫下混合，攪拌均勻，即鈦酸丁酯正丁醇溶液。將0.5 g CaO 用50 mL 去離子水溶解，混合均勻后置于已固定好鈦片的水熱反應(yīng)釜內(nèi)，然后緩慢加入鈦酸丁酯無水乙醇溶液10 mL，然后用蒸餾水加至水熱反應(yīng)釜液體填充量的80%。密閉后放入DGG-9023A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，分別在120 ℃與150 ℃條件下反應(yīng)6、12 和24 h。反應(yīng)完成后，將鈦片取出，使用蒸餾水沖洗3 遍、120 ℃干燥，再在650 ℃馬弗爐中煅燒1 h 得到的產(chǎn)品，即為樣品。③采用XRD、SEM 和EDS 對涂層組成和微觀組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析。涂層的XRD 圖得出涂層物相由CaTiO3和金紅石TiO2組成。

1.3.2 骨髓微核實(shí)驗(yàn) ①鈦浸提液的制備 將CaTiO3涂層的鈦片材料按3 cm2/mL 的介質(zhì)比例，分別置于等滲鹽水中，37 ℃恒溫箱中浸提7 d，過濾除菌后備用。②64 只小鼠隨機(jī)分為8 組:120 ℃組6、12、24 h 和150 ℃組6、12、24 h、等滲鹽水組和環(huán)磷酰胺組，每組8 只。分組前禁食16 h，分組后腹腔注射方式染毒，1 次/d，120 ℃組6、12、24 h 和150 ℃組6、12、24 h 分別注射120 ℃6、12、24 h 和150 ℃6、12、24 h 條件下的鈦片浸提液，等滲鹽水組注射等滲鹽水，環(huán)磷酰胺組注射40 mg/kg 環(huán)磷酰胺，注射量均為0.1 mL，連續(xù)注射1 周后處死。③處死小鼠取出股骨，剪去兩端骨骺，將其骨髓擠壓于已滴有小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后45°推片，吹干，甲醇固定5 min，晾干備用。然后用配制的1∶10 吉姆薩(Giemsa)-磷酸緩沖液(pH7.4)染色20 min，然后用緩沖液洗掉玻片上的染色液，晾干。④計數(shù)各組骨髓嗜多染紅細(xì)胞(bone marrow polychromatic erythrocytes，PCE)微核發(fā)生率。本實(shí)驗(yàn)每組共檢查5000 個PCE，計算公式:

PCE 微核率=含微核的PCE 總數(shù)/檢查PCE×1000‰

1.3.3 溶血實(shí)驗(yàn) ①兔血的制備:無菌條件下，抽取10 mL 健康成年新西蘭大白兔的心臟血，立即注入含有0.5 mL 20 g/L 草酸鉀抗凝劑的試管中，制備成新鮮抗凝兔血，再加入等滲鹽水稀釋，制備稀釋的抗凝兔血。②分組情況:實(shí)驗(yàn)組(血120 ℃組6、12、24 h 和血150 ℃組6、12、24 h)試管內(nèi)分別放置5 g樣品;并設(shè)立陽性對照組(蒸餾水)，陰性對照組(等滲鹽水)，分別制備3 個平行樣。實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組加入10 mL 0.9%氯化鈉溶液;陽性對照組加入10 mL 蒸餾水，每組平行操作3 管以上，8 組共24 只試管，放在37 ℃恒溫水浴箱中30 min 后，每個試管加0.2 mL 稀釋兔血，繼續(xù)在恒溫水浴箱中保溫60 min，再在750 g，離心半徑10 cm，離心5 min 后，小心抽取上清液，放置于分光光度計比色皿中，用分光光度計在波長為540 nm 波長處測定吸光度(A)值，并記錄結(jié)果。計算每組3 只試管的A 值。③溶血度計算:

溶血率(%)=A－B/C－B×100%

式中A、B、C 分別為樣品、陰性對照組、陽性對照組的A 值。溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定參照文獻(xiàn)［12］。

1.3.4 新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞的提取與分化參考文獻(xiàn)［13－14］進(jìn)行新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)，并將該細(xì)胞進(jìn)行純化和傳代培養(yǎng)，每5 天傳代1 次，將傳3 代的細(xì)胞備用。

1.3.5 甲基噻唑基四鹽(Methyl thiazoly terazolium，MTT)的測定 鈦片120 ℃組6、12、24 h 和鈦片150 ℃組6、12、24 h，每組取5 個鈦片置于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，純鈦片材料孔作為對照組，以3×104/mL 的密度接種于已加有鈦片的孔內(nèi)，每孔接種100 μL，分別于培養(yǎng)1、4、8 d 后終止培養(yǎng)，PBS 漂洗3 次，去除未黏附的細(xì)胞，每孔加培養(yǎng)液2 mL 和10 μL MTT 溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔中加入200 μL DMSO 溶解，置搖床上低速振蕩10 min，然后從每孔吸出全部的上清轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，純鈦片組孔加入DMSO 200 μL。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定A490值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，各組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鈦表面CaTiO3涂層的制備及表面形狀分析涂層由CaTiO3納米微晶顆粒聚集而成，顆粒尺寸約100 nm，多成立方形，表面光滑，結(jié)晶度較高。同時，EDS 表明納米顆粒晶體由Ca、Ti 和O 元素組成，證明涂層為納米CaTiO3涂層。見圖1、圖2。

圖1 鈦表面涂層水熱反應(yīng)150 ℃24 h 的能譜分析Figure 1 Energy distribution spectrometry of titanium coating in the 150 ℃24 h group

圖2 鈦片表面CaTiO3涂層水熱反應(yīng)的SEM 圖(×50000)Figure 2 Scanning electronic microscopy of the hydrothermal reaction of CaTiO3 coating on titanium(×50000)

2.2 骨髓微核實(shí)驗(yàn) 在120 ℃6、12、24 h 和150 ℃6、12、24 h 條件下，CaTiO3涂層鈦片材料浸提液劑微核率與等滲鹽水組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);120 ℃組、150 ℃組與等滲鹽水組的微核率均顯著低于環(huán)磷酰胺組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。小鼠骨髓PCE 微核率均＜4‰，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。見表1，圖3。

表1 各組小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較)Table 1 Results of bone marrow micronucleus tests with different materials in different groups

表1 各組小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較)Table 1 Results of bone marrow micronucleus tests with different materials in different groups

與環(huán)磷酰胺組比較，*P ＜0.05

組別 n 含微核細(xì)胞個數(shù) 微核率(‰)等滲鹽水組 8 8/5000 1.6*環(huán)磷酰胺組 8 185/5000 37.0 120 ℃組6 h 8 4/5000 0.8*12 h 8 3/5000 0.6*24 h 8 5/5000 1.0*150 ℃組6 h 8 4/5000 0.8*12 h 8 6/5000 1.2*24 h 8 7/5000 1.4*

圖3 油鏡下小鼠骨髓微核試驗(yàn)(×1000)Figure 3 Results of bone marrow micronucleus test under the oil microscope(×1000)

2.3 溶血性評價 血120 ℃6、12、24 h 和血150 ℃6、12、24 h 樣品的溶血檢測結(jié)果與陽性對照組比較，可見陽性對照組上清液呈現(xiàn)紅色，實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞下沉，上清液變清，取實(shí)驗(yàn)組下層液進(jìn)行顯微鏡觀察，未見紅細(xì)胞破裂。溶血率均符合醫(yī)用材料的溶血實(shí)驗(yàn)要求(＜5%)，見表2。

表2 各組材料溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，n=3)Table 2 Results of hemolysis experiment with different materials in different groups，n=3)

表2 各組材料溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，n=3)Table 2 Results of hemolysis experiment with different materials in different groups，n=3)

陽性對照組 1.707±0.099 ＞5.00血120 ℃組6 h 0.032±0.010 0.50 12 h 0.033±0.017 0.61 24 h 0.032±0.001 0.55血150 ℃組6 h 0.036±0.005 0.75 12 h 0.032±0.008 0.51 24 h 0.028±0.012 0.31

2.4 成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的活細(xì)胞觀察成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)，可見組織塊邊沿有少量細(xì)胞游離出來，隨著培養(yǎng)時間延長，組織塊周圍細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。成骨細(xì)胞剛分離出來時為圓形，貼壁生長后變?yōu)樾切?，具有?xì)胞質(zhì)突起，數(shù)日后胞突連成網(wǎng)狀，使星形細(xì)胞相互連接，形態(tài)觀察，多為立方狀，體積小，核圓。傳代后多為梭形，細(xì)胞長滿時近似方形，部分出現(xiàn)長梭形，與成纖維細(xì)胞非常相似，可出現(xiàn)重疊生長，集落樣生長趨勢。見圖4。

圖4 倒置顯微鏡下大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)(×200)Figure 4 Morphology of the cultured osteoblasts under the inverted microscope(×200)

2.5 CaTiO3涂層的鈦片對成骨細(xì)胞生長的MTT 結(jié)果 MTT 檢測結(jié)果，鈦片120 ℃組12、24 h 和鈦片150 ℃組12、24 h 較純鈦片組同培養(yǎng)時間點(diǎn)的A 值顯著上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表3。

表3 MTT 檢測各組材料對成骨細(xì)胞的A 值比較n=5)Table 3 Results of MTT for different materials in different groups，n=5)

表3 MTT 檢測各組材料對成骨細(xì)胞的A 值比較n=5)Table 3 Results of MTT for different materials in different groups，n=5)

與純鈦片組同時間點(diǎn)比較，*P ＜0.05

組別 第1 天 第4 天 第8天純鈦片組0.019±0.011 0.341±0.143 0.731±0.121鈦片120 ℃組6 h 0.028±0.018 0.261±0.161 0.538±0.138 12 h 0.024±0.014 0.498±0.218* 0.767±0.267*24 h 0.025±0.017 0.566±0.266* 0.836±0.236*鈦片150 ℃組6 h 0.032±0.022 0.283±0.223 0.559±0.259 12 h 0.026±0.021 0.668±0.268* 0.765±0.265*24 h 0.038±0.018 0.769±0.213* 0.903±0.303*

3 討 論

根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織將“生物醫(yī)用材料”定義為用于和活組織接觸以形成功能的無生命材料，其必須符合醫(yī)用級基本標(biāo)準(zhǔn)，即材料無毒，不致癌、不致畸，不引起變態(tài)反應(yīng)、具有良好的組織性和血液相容性［15］。從廣義上講，生物醫(yī)學(xué)材料的安全性評價程序?yàn)槲锢砗突瘜W(xué)性能評價-生物學(xué)評價-臨床研究。從狹義上講，生物醫(yī)學(xué)材料的安全性能評價主要是指生物學(xué)評價。本研究選用了細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和溶血實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步的生物安全性能評價［16］。

細(xì)胞微核測試是現(xiàn)在常用的一種檢測方法，代替中期染色體畸變分析，用于輻射損傷、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、食品添加劑等的遺傳毒性檢測。微核實(shí)驗(yàn)是一種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法，用于染色體損傷和干擾細(xì)胞有絲分裂的化學(xué)毒物的快速檢測方法。骨髓中PCE 充足，微核容易辨認(rèn)，自發(fā)率低，因此作為本研究的首選。小鼠PCE 微核率正常值一般在4‰以下，而本研究結(jié)果表明CaTiO3涂覆的純鈦骨髓微核率均＜4‰，因此可初步認(rèn)為此種合成CaTiO3涂覆的純鈦方法無毒性作用，符合要求。

作為植入材料，在植入體內(nèi)后，處于組織液環(huán)境中(包括血液)，其表面結(jié)構(gòu)和性能與血液相容性緊密相關(guān)，通過材料與血液直接接觸可檢測材料的可溶性或釋放性成分的溶血性能及材料表面的溶血性能，其對后期的新骨的形成及穩(wěn)定性都有很大的關(guān)系。中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，口腔材料生物實(shí)驗(yàn)方法，溶血實(shí)驗(yàn)YY/T 0127.1-1993 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了齒科材料溶血實(shí)驗(yàn)，適用于擬長期與骨和軟組織接觸的齒科材料的體外溶血性能評價。而且溶血實(shí)驗(yàn)是用生物醫(yī)學(xué)材料進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，測定紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白游離的程度，對材料的體外溶血性進(jìn)行評價。由于本研究能敏感地反映試樣對紅細(xì)胞的影響，因而是一項有意義的篩選試驗(yàn)。本研究結(jié)果表明CaTiO3涂覆的純鈦的溶血率均＜5%，因此可認(rèn)為此種方法合成CaTiO3涂覆的純鈦無溶血作用，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

而一般材料的生物活性和促進(jìn)成骨形成的過程，是通過成骨細(xì)胞與材料的共同培養(yǎng)來研究的，主要表現(xiàn)在成骨細(xì)胞黏附、增殖、分化、成熟、礦化和成骨，其中實(shí)驗(yàn)采用了，MTT 法對鈦片表面的成骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖活性的測定［13－14］。本研究結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細(xì)胞增殖率也隨著上升，120 ℃6、12、24 h 和150 ℃6、12、24 h 和純鈦片組對成骨細(xì)胞生長都有一定的影響，而其中各組之間第1 天無明顯差異，可能是細(xì)胞在接種第1 天生長緩慢，處于細(xì)胞的潛伏期有關(guān)系，經(jīng)過一段滯留期后即開始增殖，而后幾天，細(xì)胞生長處于了穩(wěn)定狀態(tài)后，各組表現(xiàn)出了較高的MTT 代謝活性，細(xì)胞增殖率明顯上升。共同培養(yǎng)到第4 天和第8 天，材料表面的成骨細(xì)胞數(shù)量和活性明顯增加，可能是由于材料的化學(xué)組成和細(xì)胞表面的共同作用，促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖。而不同溫度在反應(yīng)6 h 與純鈦片組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是不同反應(yīng)時間對材料表面的生成物是有影響的，反應(yīng)時間作用太短，材料表面生成物對細(xì)胞作用不明顯有關(guān)系。

本研究利用簡單的水熱合成法在鈦基材表面制備CaTiO3涂層，對其生物安全性和生物相容性做了客觀的評價，研究表明CaTiO3涂層的鈦片溶血率均小于國家標(biāo)準(zhǔn)值5%，具有良好的抗溶血性能。骨髓微核試驗(yàn)的骨髓細(xì)胞微核率作用率均在4‰以下，初步可認(rèn)為具有良好的生物安全性。通過對培養(yǎng)在CaTiO3涂層的純鈦表面成骨細(xì)胞的觀察和檢測，可發(fā)現(xiàn)其生長形態(tài)良好，而且具有很好的黏附和增殖能力，可初步認(rèn)為此種方法生成的CaTiO3涂層的鈦片，在生成過程中并未帶入有毒成分和產(chǎn)生毒性物質(zhì)，而且有良好的生物相容性，為將來的材料表面改性及臨床應(yīng)用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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