陳 靜，李 威，吳 奇，匡洪影，吳效科

0 引 言

胰島素信號(hào)通路與卵巢生殖功能變化的關(guān)系，為生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域研究所關(guān)注。卵巢器官的胰島素信號(hào)通路障礙往往導(dǎo)致卵巢生殖機(jī)能的改變。臨床常見的多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)即表現(xiàn)為內(nèi)分泌失調(diào)并伴有生殖障礙及胰島素通路的異常［1］。通過緩解PCOS 患者的胰島素抵抗程度、應(yīng)用胰島素增敏劑等可以緩解PCOS患者的癥狀，提示胰島素抵抗與PCOS 發(fā)病機(jī)制之間存在著密切的聯(lián)系［2］。PCOS 的主要表現(xiàn)為對(duì)促排卵敏感提高并易發(fā)卵巢過度刺激綜合征，提示胰島素抵抗的卵巢對(duì)促性腺激素的敏感程度可能提高。

地塞米松能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的T3T 脂肪細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，地塞米松在臨床上與克羅米芬連用可以大大提高促排卵的效果［3］。推測在與克羅米芬連用的過程中地塞米松可能通過影響卵巢的胰島素信號(hào)通路從而造成了卵巢器官對(duì)促性腺激素敏感性的增加。卵巢來源的甾體激素分泌異常與多種婦科疾病密切相關(guān)。本研究對(duì)胰島素抵抗對(duì)卵巢生殖功能的影響進(jìn)行探討，并評(píng)估隱丹參酮對(duì)卵巢器官胰島素抵抗的治療作用。

1 材料與方法

1.1 藥物 純度95%隱丹參酮購于上海康九化工有限公司;地塞米松注射液購于鄭州卓峰制藥有限公司;用地塞米松、沃漫青霉素購于Sigma 公司。

1.2 試劑 DMEM/F12 培養(yǎng)基(HyClone 公司)、胎牛血清(BioSource 公司)、胰島素(Novo Nordisk公司)、隱丹參酮(上?？稻呕び邢薰?。AKT2、P-AKT2、beta-actin 抗 體 均 購 自 SANTA CRUZ(SC-7127、SC-109903、SC-130656)。氚標(biāo)記-2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-［1，2-3H］-glucose)購自PerKin Elmer 公司(328A001MC)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 所用小鼠為ICR 品系，共50 只，6 ～8 周齡，性成熟雌鼠，體重為(18±1)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(黑)2013004，動(dòng)物飼養(yǎng)于人工控制條件下，室溫22 ℃，光照周期為14 h，光照時(shí)間:6:00 ～20:00，可以自由取食、飲水。取實(shí)驗(yàn)用鼠30 只，隨機(jī)分為3 組，每組10 只:等滲鹽水組(給予等滲鹽水腹腔注射)，地塞米松a 組(地塞米松1 mg/(kg·d)腹腔注射+等滲鹽水灌胃)，隱丹參酮a 組(地塞米松1 mg/(kg·d)腹腔注射+隱丹參酮灌胃+等滲鹽水灌胃)。實(shí)驗(yàn)用雌鼠于下午15:00腹腔注射5 IU孕馬血清促性腺激素，間隔48 h 腹腔注射5 IU 人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)，進(jìn)行超數(shù)排卵處理。除空白對(duì)照組給予等滲鹽水腹腔注射外，其余2 組均給予地塞米松進(jìn)行腹腔注射。隱丹參酮灌胃組同期給予隱丹參酮灌胃處理，其余2 組給予等滲鹽水灌胃。

1.3.2 胰島素抵抗程度檢測 3 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在注射HCG 16 h 后，于第4 天清晨靜脈緩慢注射10 μ Ci 2-deoxy-D-［1，2-3H］-glucose 與2 U 胰島素的混合物，40 min 后處死小鼠，取左側(cè)卵巢、肝、脂肪，經(jīng)高氯酸消化后，用液體閃爍儀檢測單位質(zhì)量組織2-deoxy-D-［1，2-3H］-glucose 的每分鐘衰變數(shù)(disintegrations per minute，DPM)。

1.3.3 排卵數(shù)檢測 注射HCG 16 h 后處死小鼠的同時(shí)，取出輸卵管。在體式顯微鏡下撕開輸卵管壺腹部，使用0.1%透明質(zhì)酸酶消化后，計(jì)數(shù)小鼠排除的卵母細(xì)胞的個(gè)數(shù)。同時(shí)將小鼠右側(cè)卵巢固定，做石蠟切片，及HE 染色，鏡下(×200)，每張切片分5個(gè)不同視野統(tǒng)計(jì)卵泡及黃體的數(shù)目。

1.3.4 卵巢器官體外培養(yǎng) 選取經(jīng)陰道涂片確定周期穩(wěn)定并處于動(dòng)情間期的雌性ICR 小鼠20 只，處死后取出卵巢在顯微鏡下剝離周圍組織，放入含有等滲鹽水的50 mm 培養(yǎng)皿中，用配備好的DMEM 和5%BSA 的混合液沖洗卵巢3 次以上進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)液成分:DMEM/F12 培養(yǎng)基、5% BSA、0.1%DMSO 和終濃度10 nmol/L 的胰島素。所得32 個(gè)卵巢隨機(jī)分為4 組，每組8 個(gè)卵巢:空白對(duì)照組(空白培養(yǎng)液)、地塞米松b 組(地塞米松單獨(dú)作用)、隱丹參酮b 組(地塞米松與隱丹參酮共同作用)、沃曼青霉素組(地塞米松與隱丹參酮共同作用的同時(shí)加入沃曼青霉素)，每2 只卵巢一組置于24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行體外培養(yǎng)，每組分為4 個(gè)復(fù)孔。根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)的研究結(jié)果［4－5］，培養(yǎng)液中地塞米松的終濃度為1 μmol/L，隱丹參酮終濃度為300 nmol/L，保證體外培養(yǎng)藥物濃度與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相一致。沃漫青霉素參照文獻(xiàn)［6］，終濃度1 μmol/L。所有卵巢在空氣濕度95%，CO2含量5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.5 體外培養(yǎng)卵巢組織葡萄糖攝取的測定 培養(yǎng)結(jié)束后更換新的2 mL 培養(yǎng)液并同時(shí)加入終濃度為100 nmol/L 的胰島素，作用60 min 后，分別收集培養(yǎng)液，檢測培養(yǎng)基中殘留的葡萄糖濃度。將原始培養(yǎng)液葡萄糖濃度與殘留培養(yǎng)液濃度的差值與培養(yǎng)液體積相乘，并與培養(yǎng)液中卵巢組織的質(zhì)量作比，即可得到單位質(zhì)量卵巢組織在胰島素刺激后所吸收的葡萄糖的量，檢測PI3K 信號(hào)通路變化對(duì)卵巢功能的影響。

1.3.6 激素水平測定 收集培養(yǎng)液上清及小鼠血清，采用化學(xué)發(fā)光法，測定上清中睪酮、孕酮、雌二醇水平。

1.3.7 Western blot 檢測 取小鼠卵巢組織，加裂解液制備組織勻漿，離心后取上清，測蛋白濃度，加蛋白上樣液，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別以山羊抗小鼠AKT2 多克隆抗體(1∶3000)、兔抗小鼠P-AKT2(1∶3000)抗體和兔抗小鼠beta-actin 抗體(1∶3000)一抗孵育雜交過夜，洗膜后在過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗羊的IgG(1∶3000)二抗中孵育1 h，以化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間均數(shù)比較均采用單因素方差分析。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠卵巢胰島素抵抗程度評(píng)估 地塞米松a組與等滲鹽水組比較，胰島素靶器官肝、脂肪、卵巢的氚標(biāo)記葡萄糖吸收量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，顯示肝、脂肪、卵巢器官都有糖攝取的障礙，產(chǎn)生胰島素抵抗。隱丹參酮a 組較地塞米松a 組葡萄糖攝取量明顯上升(P ＜0.01)。見表1。

2.2 卵巢胰島素抵抗小鼠排卵數(shù)的變化 體式顯微鏡下檢測結(jié)果顯示:與地塞米松a 組排卵數(shù)目、平均黃體數(shù)比較，等滲鹽水組和隱丹參酮a 組均顯著降低(P ＜0.01)。3 組小鼠同一視野內(nèi)平均卵泡數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

表1 不同組織氚標(biāo)記葡萄糖的吸收量，DPM/mg)Table 1 2-deoxy-D-［1，2-3H］-glucose uptake of murine tissue，DPM/mg)

表1 不同組織氚標(biāo)記葡萄糖的吸收量，DPM/mg)Table 1 2-deoxy-D-［1，2-3H］-glucose uptake of murine tissue，DPM/mg)

與等滲鹽水組比較，*P ＜0.05;與地塞米松a 組比較，#P ＜0.05

組別 n 肝 脂肪 卵巢等滲鹽水組10 4048.5±1276.3 761.5±123.3 3447.2±1245.2地塞米松a 組 10 2011.0±576.7* 553.7±33.3* 1183.2±382.2*隱丹參酮a 組 10 3541.2±880.7# 963.6±223.7# 2805.2±921.5#

表2 超數(shù)排卵小鼠排卵及相關(guān)指標(biāo)的比較，個(gè))Table 2 Statistics of murine ovulation rate after super ovulation，count)

表2 超數(shù)排卵小鼠排卵及相關(guān)指標(biāo)的比較，個(gè))Table 2 Statistics of murine ovulation rate after super ovulation，count)

與等滲鹽水組比較，*P ＜0.01;與地塞米松a 組比較，#P ＜0.01

組別 n 排卵數(shù) 平均黃體數(shù) 平均卵泡數(shù)等滲鹽水組10 26.3±5.9 3.5±1.6 7.3±1.9地塞米松a 組 10 37.5±7.0* 5.0±1.8* 6.9±2.7隱丹參酮a 組 10 27.2±6.3# 3.8±0.9#6.9±3.1

2.3 胰島素抵抗小鼠血清激素水平變化 在發(fā)生胰島素抵抗后，地塞米松a 組血清雌二醇及孕酮水平較等滲鹽水組和隱丹參酮a 組均顯著上升(P ＜0.05)。見表3。

2.4 體外培養(yǎng)小鼠卵巢激素分泌比較 地塞米松b 組培養(yǎng)液睪酮水平［(1.88±0.44)nmol/L］較空白對(duì)照組［(0.47±0.01)nmol/L］顯著上升(P ＜0.01)，而地塞米松b 組孕酮水平［(11.42±10.30)nmol/L］較空白對(duì)照組［(35.79±17.83)nmol/L］顯著下降(P ＜0.01);各組雌二醇水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

表3 各組小鼠血清激素水平比較Table 3 Murine serume hormone level

表3 各組小鼠血清激素水平比較Table 3 Murine serume hormone level

與等滲鹽水組比較，*P ＜0.05;與地塞米松a 組比較，#P ＜0.05

組別 n 雌二醇(pmol/L) 孕酮(nmol/L)等滲鹽水組10 127.8±2.1 67.8±13.5地塞米松a 組 10 238.5±19.7* 93.3±8.6*隱丹參酮a 組 10 140.4±34.4# 79.8±10.2#

2.5 胰島素抵抗小鼠卵巢胰島素信號(hào)通路變化AKT2 蛋白分子表達(dá)量比較，等滲鹽水組(0.84±0.02)與地塞米松a 組(0.85±0.05)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);P-AKT2 蛋白含量比較，地塞米松a 組(0.39±0.01)較等滲鹽水組(0.77±0.03)顯著降低(P ＜0.05)。見圖1。

2.6 體外培養(yǎng)小鼠卵巢中葡萄糖攝取評(píng)估 體外培養(yǎng)的卵巢組織中每毫克組織葡萄糖攝取量，隱丹參酮b 組和空白對(duì)照組較地塞米松b 組、沃曼青霉素組均顯著升高(P ＜0.01)。見表4。

表4 小鼠卵巢中葡萄糖攝取量DPM/mg)Table 4 Murine ovarian 2-deoxy-D-［1，2-3H］-glucose uptake，DPM/mg)

表4 小鼠卵巢中葡萄糖攝取量DPM/mg)Table 4 Murine ovarian 2-deoxy-D-［1，2-3H］-glucose uptake，DPM/mg)

與地塞米松b 組比較，*P ＜0.01;與沃曼青霉素組比較，#P ＜0.01

組別 葡萄糖攝取量空白對(duì)照組 3 447.2±1 245.2*#地塞米松b 組 1 183.2±382.2隱丹參酮b 組 2 805.2±921.5*#沃曼青霉素組1 364.2±292.3

3 討 論

在脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)試驗(yàn)中，地塞米松作為誘導(dǎo)藥物，能夠?qū)е轮炯?xì)胞發(fā)生胰島素抵抗［7］;而卵巢胰島素抵抗的PCOS 患者中，往往能夠發(fā)現(xiàn)卵巢中卵泡過度發(fā)育，激素水平異常升高等現(xiàn)象［8］。這些證據(jù)都提示，卵巢胰島素抵抗很可能與卵巢功能的亢進(jìn)有關(guān)。在本研究中，誘導(dǎo)小鼠發(fā)生全身性的胰島素抵抗后，卵巢器官存在著胰島素抵抗的現(xiàn)象。在促性腺激素的刺激下，地塞米松組卵巢較空白對(duì)照組表現(xiàn)為排卵數(shù)目提高和激素分泌水平提高，說明在胰島素抵抗的情況下，卵巢功能發(fā)生亢進(jìn)現(xiàn)象。同時(shí)，對(duì)卵巢超排后黃體數(shù)和卵泡數(shù)的檢測則表明，地塞米松所誘導(dǎo)的胰島素抵抗提高了小鼠在同一周期內(nèi)的排卵數(shù)目，即地塞米松組小鼠黃體數(shù)目增加;但沒有明顯改變卵巢的卵泡儲(chǔ)備量，說明胰島素抵抗提高了卵巢對(duì)促性腺激素的敏感程度，提高了卵巢的排卵能力，但并沒有明顯影響卵巢的卵子儲(chǔ)備。臨床治療當(dāng)中，也能夠發(fā)現(xiàn)由于糖皮質(zhì)激素分泌亢進(jìn)所導(dǎo)致的庫欣氏綜合征?；加袔煨朗暇C合征的患者其卵巢也會(huì)發(fā)生多囊樣改變［9］。根據(jù)這些現(xiàn)象，本研究推測，臨床在促排卵的過程中應(yīng)用地塞米松，也可能造成了卵巢短期的胰島素敏感性降低從而提高了卵巢的促性腺激素敏感性。

糖皮質(zhì)激素能夠誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗，其主要的機(jī)制是阻礙了胰島素信號(hào)通路蛋白的磷酸化水平［10－11］。在體外誘導(dǎo)卵巢胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，本研究借鑒了脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)胰島素抵抗的結(jié)果，應(yīng)用高劑量糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)卵巢組織的胰島素抵抗。在脂肪細(xì)胞當(dāng)中，地塞米松能夠阻礙葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨細(xì)胞膜易位功能，降低PI3K 通路蛋白的磷酸化水平但對(duì)總蛋白的表達(dá)量沒有明顯的影響［12］。本研究在卵巢組織當(dāng)中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，胰島素PI3K 通路的標(biāo)志分子AKT2 其基礎(chǔ)蛋白水平在地塞米松誘導(dǎo)后變化不明顯，而在地塞米松組小鼠卵巢中AKT2 的磷酸化水平顯著降低。信號(hào)通路的改變體現(xiàn)在信號(hào)分子表達(dá)量及活性兩個(gè)方面，PI3K 通路關(guān)鍵分子AKT2 磷酸化水平的變化會(huì)直接影響卵巢的胰島素敏感性。本研究前期發(fā)現(xiàn)，AKT2 基因缺失的小鼠表現(xiàn)為高雄激素血癥及胰島素抵抗，與PCOS 臨床癥狀相似［13］。地塞米松誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠卵巢也表現(xiàn)出酪氨酸磷酸化降低的現(xiàn)象，這說明PI3K 信號(hào)通路磷酸化的異常是造成卵巢胰島素抵抗的關(guān)鍵因素。隱丹參酮在體內(nèi)及體外的實(shí)驗(yàn)中均體現(xiàn)出拮抗地塞米松并激活PI3K 通路的生物學(xué)效應(yīng)，而其作用效果能夠被PI3K 抑制劑沃漫青霉素所抑制，提示中藥隱丹參酮很可能通過激活PI3K 途徑發(fā)揮治療效應(yīng)。

中藥丹參性微寒，味苦，無毒，有活血、通絡(luò)、涼血、消腫的作用。丹參中抗菌消炎的有效成份為隱丹參酮。雖然隱丹參酮單體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能夠有效的改善小鼠葡萄糖代謝水平，但中藥隱丹參酮的作用機(jī)制尚不十分明確，尤其在治療PCOS 的過程當(dāng)中。在臨床治療過程中，隱丹參酮能降低女性血清雄激素水平并治療痤瘡［14］。女性體內(nèi)雄激素的來源主要來自于卵巢細(xì)胞，本研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮對(duì)于糖皮質(zhì)激素所誘導(dǎo)的卵巢功能異常有很強(qiáng)的拮抗作用。體外培養(yǎng)的隱丹參酮處理組卵巢較地塞米松組，葡萄糖攝取量提高、卵巢睪酮、孕酮的表達(dá)水平及對(duì)促性腺激素的敏感性均降低。在本研究中檢測到隱丹參酮能夠調(diào)節(jié)PI3K 通路關(guān)鍵分子的磷酸化水平，且這種調(diào)節(jié)作用能夠被PI3K 途徑抑制劑沃漫青霉素所抑制，說明隱丹參酮能夠通過PI3K 途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。也有研究結(jié)果顯示，隱丹參酮能夠直接調(diào)節(jié)甾體激素合成酶的表達(dá)［15］。雖然本研究結(jié)果表明，PI3K 通路與甾體激素合成之間存在聯(lián)系，但隱丹參酮究竟是調(diào)節(jié)PI3K 通路還是直接作用于甾體激素合成酶的表達(dá)還有待進(jìn)一步的證實(shí)。

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