林堅平，沈寧江，史占軍，王健，肖軍，吳多能，張武

(1.海南省人民醫(yī)院關節(jié)外科，海南 ?？?570311；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院關節(jié)外科，廣東 廣州 510515)

實驗研究

NTX在兔實驗性骨不連早期診斷中的作用

林堅平1，2，沈寧江1，史占軍2，王健2，肖軍2，吳多能1，張武1

(1.海南省人民醫(yī)院關節(jié)外科，海南 ?？?570311；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院關節(jié)外科，廣東 廣州 510515)

目的 建立骨不連的動物模型，發(fā)現(xiàn)實驗性骨不連的生化指標變化規(guī)律。方法 選取純種新西蘭大白兔分為兩組，實驗組在前臂橈骨中段截除1.5 cm(包括骨膜)，骨斷端用骨蠟封閉髓腔，對照組只是在前臂橈骨中段造成骨折，兩組分別于術前、術后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周進行X線檢查及抽取血樣。骨形成特異標志物選擇：骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase，BSAP)。骨吸收特異標志物包括Ⅰ型膠原氨基端末肽(N-terminal telopeptide of type I collagen，NTX)，人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRACP 5b)。檢測方法采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。結果 實驗組第2周3 例有少許骨痂形成，但5周后骨痂情況穩(wěn)定，術后8周仍無一例愈合。骨折組術后2周開始骨折線模糊，術后6～8周骨痂大量生長。兩組間的BSAP、NTX有統(tǒng)計學意義(NTXF值187.512，P<0.001。BSAPF值16.051，P=0.001)，BSAP術前、術后兩組內(nèi)各數(shù)值無統(tǒng)計學意義，TRACP 5b術前術后、組間、組內(nèi)各數(shù)值無統(tǒng)計學意義。實驗組NTX在術后5周開始出現(xiàn)明顯下降，術后5周與術前術后各個時間均有統(tǒng)計學意義，術后7周、8周、10周、12周均與術后3周、4周、5周有統(tǒng)計學意義，術后6周以后NTX水平基本穩(wěn)定。結論 新西蘭大白兔骨不連缺損的模型可以選擇為前臂橈骨中段，截除1.5 cm(包括骨膜)，骨斷端用骨蠟封閉髓腔。多個血清生化指標的檢測有益于骨折愈合過程的臨床評估。術后5周，NTX的顯著下降，是否可以早期診斷兔實驗性骨不連。

骨不連；生物標志物；人抗酒石酸酸性磷酸酶5b；Ⅰ型膠原氨基端末肽；骨特異性堿性磷酸酶；生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法

骨不連的診治研究一直是骨科醫(yī)師長期關注的課題，然而其診斷和隨訪當前仍主要由傳統(tǒng)的X線來完成。這種方法僅僅依賴于臨床醫(yī)師的經(jīng)驗和骨折愈合中骨痂的礦化程度來判斷骨折愈合情況，易受投照、沖洗條件及主觀因素影響，精確度欠佳，如果骨鹽含量變化低于25%，X線就失去了分辨的價值，所以，探索監(jiān)測骨愈合過程新的可行性方法勢在必行。B超、振動響應、機械阻抗分析及人工神經(jīng)網(wǎng)絡對骨的整體機能、力學狀態(tài)和變化已有廣泛的研究，但生物因子監(jiān)測骨折愈合資料目前在國內(nèi)外少見報道[1]。為了豐富骨折愈合的診斷標準在分子生物學水平上的具體內(nèi)容，解決其早期診斷和預測，進一步對促骨生長藥物的療效評定提供客觀依據(jù)，本研究利用骨代謝異常先于形態(tài)學變化、生物標志物測量骨量變化時間遠早于骨密度監(jiān)測技術的基本原理，借助于骨不連時骨轉換平衡破壞學說[2]，通過骨吸收-形成偶聯(lián)與膠原代謝、生長因子、血管介導及成骨細胞的關系，選擇反映骨轉換的特異標志物并檢測其在骨折愈合過程中不同時期的濃度，與形態(tài)學標準(X線)相比較，動態(tài)觀察和探討兩者的相關性，希望由此發(fā)現(xiàn)某些特定的生物因子是骨折愈合或不愈合的標志物，并建立具有應用價值的數(shù)據(jù)庫。本實驗研究建立骨不連的動物(兔)模型，術后X線和生物標志物定期監(jiān)測，探討生物標志物在早期診斷骨不愈合的臨床價值，發(fā)現(xiàn)實驗性骨不連的早期生物標志物變化規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 一般材料 手術器械：刀柄，刀片，蚊式鉗，手外科小骨刀，咬骨鉗，組織剪，線剪，無菌手術巾單，1號縫合線，手術臺，肢體固定用繩索。檢測儀器：消毒游標卡尺，X線機。實驗用藥品：動物用阿莫西林粉劑，1%鹽酸利多卡因，絡合碘，石灰水。動物喂養(yǎng)：兔籠，兔飼料等。

1.2 實驗動物及處理 選取純種新西蘭大白兔20只(5～6個月月齡)，體重為2.5～3.0 kg，雌雄各半，隨機分為兩組，每組10只。實驗組在前臂橈骨中段截除1.5 cm(包括骨膜)，骨斷端用骨蠟封閉髓腔，對照組只是在前臂橈骨中段造成骨折，不行內(nèi)固定。術后將兔放入籠中，單兔單籠，自由活動。

1.3 手術方法 將實驗兔用體積分數(shù)3%戊巴比妥鈉以20 mg/kg耳緣靜脈注射以及氯胺酮以50 mg/kg肌肉注射麻醉。麻醉成功后將兔固定于手術臺，均取兔右側前肢，剪去兔毛，絡合碘消毒術區(qū)，鋪無菌孔巾，取前肢橈骨中段之縱形皮膚切口，長2.5～3 cm。逐層切開后，顯露橈骨中段，實驗組切除骨膜，以橈骨中段處曲度最大處為標點在橈骨中遠段骨干處以鋒利小骨刀截取15 mm橈骨干，以游標卡尺量長，長度誤差控制在0.1 mm。以小咬骨鉗修整斷端使其盡量平整，同時盡量使截取部位位于橈骨中遠段，骨斷端用骨蠟封閉髓腔，對照組只是在前臂橈骨中段造成骨折。兩組均不固定骨折部位，1號絲線分別縫合皮膚、皮下，術后絡合碘消毒切口皮膚2次/d，術后12 d拆線。術后予口服阿莫西林1周。

1.4 X線和生物標志物檢測 兩組分別于術前、術后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周進行前臂的放射學檢查(攝X線片，觀察橈骨缺損區(qū)愈合情況)及抽取2 mL血清，存于-80℃。

1.5 檢測指標 骨形成特異標志物選擇骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase，BSAP)。骨吸收特異標志物包括Ⅰ型膠原氨基端末肽(N-terminal telopeptide of type I collagen，NTX)，人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRACP 5b)。

1.6 檢測方法 采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)：以檢測NTX為例，向預先包埋了NTX單克隆抗體的酶標孔中加入NTX，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗NTX抗體，再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顏色的深淺與樣品中NTX的濃度呈正相關。

2 結 果

2.1 手術后兔觀察結果 20只手術兔切口未見感染，無一例實驗兔死亡，全部進入結果分析。

2.2 影像學檢查結果 實驗組術后第2周3 例有少許骨痂形成，但5周后骨痂情況穩(wěn)定，術后8周仍無一例愈合。對照組術后2周開始骨折線模糊，術后6～8周骨痂大量生長(見圖1～2)。

圖1 實驗組術后8周未見愈合 圖2 對照組術后8周骨痂大量生長

圖3 術前至術后12周BSAP血清濃度變化

圖4 術前至術后12周NTX血清濃度變化

圖5 術前至術后12周TRACP5b血清濃度變化

統(tǒng)計學分析結果：兩組間的BSAP、NTX有統(tǒng)計學意義(NTXF值187.512，P<0.001，BSAPF值16.051，P=0.001)，BSAP術前術后、兩組內(nèi)各數(shù)值無統(tǒng)計學意義，TRACP 5b術前術后、組間、組內(nèi)各數(shù)值無統(tǒng)計學意義。實驗組NTX在術后5周開始出現(xiàn)明顯下降，術后5周與術前術后各個時間均有統(tǒng)計學意義，術后7周、8周、10周、12周均與術后3周、4周、5周有統(tǒng)計學意義，術后6周以后NTX水平基本穩(wěn)定。

3 討 論

近年來，關于骨不連、延遲愈合及其他原因所造成的骨缺損的研究較多，大量研究集中在實驗動物上。骨不連模型的試驗動物選擇基本原則是該實驗動物與人類的解剖和生理特點較為接近，通過該動物的實驗研究基本能再現(xiàn)人類相關疾病的客觀規(guī)律，并有較良好的重復性。近年來，有選用較大的動物如豬、馬、牛、羊、猴等動物的傾向，但有購置動物成本高、飼養(yǎng)條件高、實驗設計難度大的弊端。而體型較小的動物，雖然具有骨骼小、愈合快、適于細胞學研究的優(yōu)點，但其缺點是不便于骨折固定[3]。研究顯示兔的肢體骨與人類較為接近，且有體形小、易馴服、組織修復較快、繁殖周期較短、飼養(yǎng)管理及操作方便、費用便宜、對大樣本有利。故本研究選擇了新西蘭大白兔。

實驗動物骨缺損模型是進行組織工程研究的基礎，若缺損長度不足夠，實驗動物骨缺損可自行愈合，則再進行實驗組織工程研究已無必要性，只有實驗動物骨缺損長度無法自行愈合才能再次進行骨組織工程修復。骨缺損的愈合程度主要決定于缺損的大小，其次是實驗動物的月齡、體質(zhì)量及雌雄等條件考慮在內(nèi)。新西蘭大白兔由于其前肢由尺橈骨組成，取其橈骨中段作骨缺損，同時完整的尺骨起到前肢的支撐作用，無需實行內(nèi)固定，是較為常用的模型。Johnson等[4]指出完全性骨缺損需要在一些不利于骨生長的環(huán)境中進行，如骨缺損超過骨干直徑的三四倍(即不能自行修復的長度)、骨局部肌肉覆蓋較少、紅骨髓含量少的成年動物。國內(nèi)外關于橈骨缺損模型的長度存在一定的差異。按照Stephen標準，缺損值達到骨直徑的1.5～2.0倍即可認為是骨缺損臨界值[5]，新西蘭大白兔橈骨平均直徑在4～5 mm，比較多的學者喜歡采用橈骨中段缺損1.5 cm作為缺損模型。Kasten等[6]、Niemeyer等[7]及Geiger等[8]取兔橈骨中段作橈骨遠端1.5 cm骨段(包括骨膜)造骨缺損模型，經(jīng)10周發(fā)現(xiàn)骨缺損區(qū)為纖維瘢痕組織填充，無骨性連接，骨蠟未吸收，骨端硬化，髓腔封閉，兩斷端有少量骨痂形成。

本實驗通過術后X線檢測，證實15 mm長度實驗組骨缺損端均為纖維組織連接，骨斷端髓腔封閉。實驗兔骨折愈合時間一般為6周，12周未愈合視為骨不連。本實驗觀察時間達術后12周，15 mm長度實驗組均未愈合，確定骨不連模型制作成功。

研究骨不連的手段包括骨形態(tài)計量學、骨礦鹽密度和骨代謝生化指標的測定等，由于骨代謝生化指標具有無創(chuàng)性、可重復檢測而成為人們認識和進一步研究骨不連的有力手段。人體骨骼是動態(tài)變化的組織，大約每年有10%的骨骼被更新。骨形成、骨吸收和靜止3個階段構成了骨的重建過程；骨轉換的過程即是破骨細胞不斷清除舊骨，成骨細胞形成類骨質(zhì)并進行礦化的過程，這兩個過程在時間和空間上緊密耦聯(lián)并發(fā)生在同一重建單位中。整個骨吸收-骨重建過程受成骨細胞調(diào)控。骨量的多少取決于同一骨重建單位中骨形成與骨吸收的平衡。當這一平衡被破壞，骨吸收大于骨形成時，就導致了骨不連的發(fā)生。骨轉換過程可以通過生化標志物反映出來，間接顯示成骨細胞與破骨細胞的活性。

近些年來研究者更多的采用BSAP、TRACP 5b、NTX等這些敏感性、特異性強的骨代謝生化指標，用于骨丟失率監(jiān)測、骨折風險程度預測、監(jiān)測藥物治療反應及代謝性骨病的鑒別診斷中，這些指標是否比骨密度測量更能早期反映骨量變化令人期待。

BSAP是成骨細胞的胞外酶，能排除肝、腎、腸等疾病影響，是反映成骨細胞活性和骨形成的特異及敏感指標，成骨細胞活性增強，則BSAP分泌增加。有些專家進行調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，BSAP可以作為一種敏感的標志物來測定骨轉換率。Southwood等[9]報道兔股骨缺損試驗中，術后0～4周血清BSAP減少，在8周達到高峰，然后減少。Moghaddam等[10]在248 例長骨骨折外科治療病例中，選取萎縮性不愈合15 例對比15 例正常骨愈合。術后1、2、4、8、12、52周生物因子檢測。發(fā)現(xiàn)：BSAP和Ⅰ型前膠原氨基端前肽(procollagen type Ⅰ N-terminal propeptide，PINP)水平在1周內(nèi)升高后減少，但在兩組絕對值和相對值在愈合過程無明顯差異。本試驗研究中，實驗組BSAP術后升高，第4周達到高峰，第5周時出現(xiàn)下降，第6周以后數(shù)值基本穩(wěn)定。兩組的BSAP有統(tǒng)計學意義，但兩組內(nèi)未見顯著性差異。和Southwood等[9]、Moghaddam等[10]的結果一樣，骨缺損刺激骨的形成，BSAP術后均出現(xiàn)升高現(xiàn)象。動態(tài)分析BSAP的變化，對兔實驗性骨折愈合過程的監(jiān)測有一定的幫助。

人抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP)和Ⅰ型膠原C端肽(C-terminal telopeptide of type I collagen，CTX)是6種酸性磷酸酶同工酶之一，即第5型，主要由破骨細胞釋放，檢測血清中TRACP的水平可以反映體內(nèi)破骨細胞活性和骨吸收狀態(tài)。正常人血清中會有兩種幾乎等量的5型TRACP，即5a和5b。5a可以在唾液酸酶作用下轉變?yōu)?b，純化的人破骨細胞TRACP是5b。TRACP 5b由于其特異性高、結果不受晝夜變化、飲食、肝、腎疾病的影響，已經(jīng)成為第二代骨吸收的生化標志物，具有早期監(jiān)測骨質(zhì)，降低骨折的風險作用。

Moghaddam等[10]外科治療病例中，生物因子檢測發(fā)現(xiàn)：術后在4周和8周，TRACP 5b相對值明顯減少，但兩組絕對值和相對值在愈合過程無明顯差異。本實驗研究中，實驗組TRACP 5b術后升高，在第4周出現(xiàn)明顯峰值，然后下降，基本穩(wěn)定。實驗組和骨折組CTX基本平行，兩組間CTX有統(tǒng)計學意義，實驗組CTX第5周時出現(xiàn)一個高峰值，但兩組內(nèi)未見明顯差異。TRACP 5b和CTX術后均有絕對值的升高，提示著骨缺損后骨吸收會增強，系統(tǒng)性TRACP 5b和CTX變化能反映成功骨折愈合早期進程，有可能可以臨床監(jiān)測愈合過程。

NTX是含有吡啶啉和脫氧吡啶啉的低分子肽，其結構是通過吡啶啉(lysyl pyridinoline，LP)和脫氧吡啶啉(hydroxylysyl pyridinoline，HP)分別連接兩條鏈末端肽，是I型膠原交聯(lián)末端肽，為總的N端交聯(lián)物。LP主要存在于骨中，占成熟膠原的21%，HP存在于軟骨與骨中，是成熟膠原的主要成份[11-13]。LP和HP在破骨細胞骨吸收過程中，從骨基質(zhì)中釋放出來，以游離氨基酸形式或肽結合形式，即NTX，從尿中排出，是骨降解后尿中出現(xiàn)的一種穩(wěn)定最終產(chǎn)物。從理論上講NTX的骨組織特異性很強并與骨吸收密切相關。Garcia-perez等[12]研究發(fā)現(xiàn)，NTX用于監(jiān)測骨吸收變化方面是最敏感的指標。Rosen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NTX和骨密度呈負相關。本研究中，實驗組NTX在第5周出現(xiàn)明顯的降低，從第6周開始出現(xiàn)平穩(wěn)的NTX水平，與骨折組有明顯的差異。

分析兩組手術前后骨代謝指標的變化發(fā)現(xiàn)，實驗組治療前后，BSAP和TRACP 5b均有波動，雖然組內(nèi)未見顯著性差異，但是至少說明實驗組骨轉換維持在較高水平，多個血清生化指標的檢測有益于骨折愈合過程的臨床評估。實驗組中NTX術后第5周的下降最明顯，有顯著性差別，是否可以說明NTX能敏感地反映體內(nèi)骨轉換的狀態(tài)，能快速隨骨吸收被抑制迅速降低。在排除其他干擾因素情況下，術后5周NTX的顯著下降，是否可以作為反映骨轉換情況、早期診斷兔的骨不連，有待于我們進一步研究。

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Serum N-terminal Telopeptide of Type I Collagen Concentration for Early Diagnosis of Fracture Nonunion in Rabbits

Lin Jianping1，2，Shen Ningjiang1，Shi Zhanjun2，etal

(1.Department of Orthopedic Surgery，People′s Hospital of Hainan Provincial，Haikou 570311，China；2.Department of Orthopedic Surgery，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China)

Objective Purpose The aim of this study was to establish an experimental animal model of fracture nonunion，and investigate the changes in serum biomarker concentrations in fracture nonunion.Methods Twenty purebred New Zealand rabbits were divided into two groups.In the bone defect group，a 15-mm length of bone (including the periosteum)was removed from the mid-radius，and the medullary cavities were closed with bone wax.In the bone fracture group，the mid-radius was fractured.X-rays were taken and blood samples were collected preoperatively and at 2，3，4，5，6，7，8，10，and 12 weeks after surgery.The serum concentrations of bone-specific alkaline phosphatase (BSAP)as markers of bone formation，and of N-terminal telopeptide of type I collagen (NTX)，and tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP 5b)as markers of bone resorption，were measured using biotin double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay.Results In the bone defect group，bone callus was observed on X-ray at 2 weeks in three rabbits and the bone calluses stabilized at 5 weeks，but none of the bones had healed at 8 weeks.In the bone fracture group，the fracture line was blurry at 2 weeks and bone calluses formed at 6-8 weeks.In the bone defect group，the serum BSAP and TRACP 5b concentrations increased after surgery，peaked at 4 weeks，began to decrease at 5 weeks，and stabilized after 6 weeks.The serum NTX concentration fluctuated during the first 4 weeks，was significantly lower at 5 weeks than at all other time points，and stabilized after 6 weeks.Conclusion These results show that a bone nonunion model can be established in New Zealand rabbits by resecting a 15-mm length of bone from the mid-radius with bone wax blocking.Measurement of the serum BSAP，NTX，and TRACP 5b concentrations may be useful for the early detection of bone nonunion.The serum NTX concentration changed significantly in rabbits with bone nonunion.Further studies are needed to determine the feasibility of using the serum NTX concentration for the early diagnosis of bone nonunion.

nonunion；biomarkers；tartrate-resistant acid phosphatase 5b；N-terminal telopeptide of type I collagen；bone-specific alkaline phosphatase；enzyme-linked immunosorbent assay

1008-5572(2015)09-0812-05

海南省自然科學資金資助課題(808212)

R683

A

2015-04-10

林堅平(1971- )，男，主任醫(yī)師，海南省人民醫(yī)院關節(jié)外科，570311。