徐 兵,鄭麗雪,翁渝潔,冀 宏

(常熟理工學院生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500)

常熟虞山松蕈優(yōu)良菌株選育及深層發(fā)酵條件的優(yōu)化

徐 兵,鄭麗雪,翁渝潔,冀 宏*

(常熟理工學院生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500)

針對常熟虞山松蕈菌株篩選及深層發(fā)酵條件優(yōu)化展開研究。以松蕈深層液體發(fā)酵的生物量、菌絲球直徑、菌絲體密度及菌絲體日生長速率為指標,篩選得到松蕈2號菌株。進一步優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵條件。通過單因素實驗研究了培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速及發(fā)酵周期對松蕈深層發(fā)酵的影響。最后,通過響應面實驗優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件為溫度25 ℃,搖床轉(zhuǎn)速170 r/min,發(fā)酵周期8.5 d。在此條件下培養(yǎng)后,松蕈菌絲體干重達14.5 mg/mL。

虞山松蕈,菌株篩選,深層發(fā)酵,優(yōu)化

松蕈,即松茸,屬于真菌門,擔子菌亞門,層菌綱,傘菌目,口磨科,口磨屬[1],是國家二級保護植物。常熟地區(qū)虞山自古以來自然環(huán)境使然,適者生存,松林的空氣中就含有蕈的孢子,當溫濕度條件適宜時,就會生長出松蕈子實體。虞山蕈油面是江蘇常熟漢族傳統(tǒng)的特色面點,有“素中之王”之稱,用蕈油作為面“澆頭”的蕈油面,鮮美異常,非一般蘑菇可比。經(jīng)研究表明,松蕈含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、微量元素、人體必需氨基酸及多糖,其中松蕈多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用、抗衰老、抗輻射、抗糖尿病、美白、抗炎抗菌等作用[2-6]。食用菌的栽培工藝主要是采用固體菌種技術,采用固體菌種技術已培育出多種食用菌,但固體栽培受到季節(jié)、原材料、生長周期、成本和易污染等限制。實踐證明,食用菌深層液體發(fā)酵工藝制備液體菌種可替代固體菌種用于生產(chǎn)[7],采用深層發(fā)酵工藝制備食用菌液體菌種是當前研究的熱點。目前,還未見關于人工固體栽培松樹蕈及深層液體發(fā)酵工藝制備液體菌種方面的研究。

本文針對常熟虞山松蕈菌株篩選及深層發(fā)酵條件優(yōu)化展開研究,旨在為實現(xiàn)松蕈的工廠化生產(chǎn)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松蕈 江蘇常熟虞山,6個松蕈子實體分別編號為松蕈1號,松蕈2號,松蕈3號,松蕈4號,松蕈5號,松蕈6號。

5418R型小型臺式高速冷凍離心機 eppendorf中國有限公司;MJ-250BS-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;WGL-45B型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;GHP-9160型隔水式培養(yǎng)箱 上海申賢恒溫設備廠;M124A型電子天平 蘇州賽恩斯儀器有限公司;ZQLY-180型全溫震蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器;CJ-1S型潔凈工作臺 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種選育培養(yǎng)基制備 固體培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,胰蛋白胨4 g,磷酸二氫鉀3 g,硫酸鎂1.5 g,VB10.002 g,蒸餾水1000 mL,pH自然。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化培養(yǎng)基制備 液體培養(yǎng)基:葡萄糖30 g,酵母粉5 g,磷酸二氫鉀3.5 g,硫酸鎂1.5 g,VB10.002 g,蒸餾水1000 mL,pH自然。

1.2.3 種子液的制備 無菌操作條件下,取活化好的1 cm×1 cm菌種塊于三角瓶液體培養(yǎng)基中,每瓶接種3塊,于26 ℃,160 r/min條件下培養(yǎng)9 d。三角瓶裝液量為100 mL/250 mL。

1.2.4 搖床發(fā)酵培養(yǎng) 將松蕈種子液按照5%(v/v)的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,于26 ℃、160 r/min,培養(yǎng)9 d。

1.2.5 優(yōu)良菌株篩選 在同等條件下,將6株野生松蕈菌種分別接入PDA培養(yǎng)基中,于26 ℃培養(yǎng)活化。然后將活化好的松蕈菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng),考察菌絲球直徑、菌絲球數(shù)量、菌絲體干重及菌絲體日生長速率4個指標,篩選出液體發(fā)酵優(yōu)勢菌株。

1.2.5.1 菌絲球直徑(d)的測定 隨機取菌絲球20個,將其拍成一排,測量其總長度,重復三次,取平均值,記為D,菌絲球直徑即d=D/20[8]。

1.2.5.2 菌絲球數(shù)量的測定 取10 mL的發(fā)酵液,過80目標準篩,計數(shù)篩網(wǎng)上的菌絲球的個數(shù),此數(shù)值記為n個。則100 mL發(fā)酵液中菌絲球數(shù)目為N=10×n。

1.2.5.3 菌絲體干重的測定 取100 mL發(fā)酵醪液于80目標準篩中過濾,用蒸餾水沖洗3次,將過濾所得的菌絲體于60 ℃干燥箱中烘干至恒重,得松蕈菌絲體干重記為W。

1.2.5.4 菌絲體日生長速率的測定 在同等條件下,將不同編號的松蕈菌種分別接入PDA培養(yǎng)基中,放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),設置溫度為26 ℃。每天觀察菌絲生長情況,當菌絲體開始生長,每2 d在固定時間測定菌落直徑,連續(xù)測量5次,測量菌絲用十字交叉法。計算菌絲體日均生長速率。計算公式如下:

式(1)

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素實驗

1.2.6.1 溫度對虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 以菌絲體干重作為指標,考察不同溫度對松蕈發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響。溫度分別設定為23、24、25、26、27 ℃。搖床轉(zhuǎn)速160 r/min,培養(yǎng)時間為9 d。

1.2.6.2 搖床轉(zhuǎn)速對虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 考察不同搖床轉(zhuǎn)速對松蕈發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響。搖床轉(zhuǎn)速分別設定為120、140、160、180、200 r/min。溫度為25 ℃,培養(yǎng)時間為9 d。

1.2.6.3 發(fā)酵周期對虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 以菌絲體干重作為指標,考察發(fā)酵周期對松蕈發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響。培養(yǎng)溫度為25 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

1.2.7 響應面實驗設計 采用響應面法中的Box-Behnken模型對影響松蕈菌絲體生長的關鍵因素(溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵周期)進行優(yōu)化。數(shù)據(jù)處理軟件為Design Expert 8.05 b。

設溫度、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期為自變量,分別為A,B,C,每個自變量中的低、中、高水平以-1,0,1進行編碼,以菌絲體干重為因變量R進行實驗設計,所有實驗重復3次。

表1 編碼與因子的實際濃度的對應關系

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良菌株篩選實驗

2.1.1 不同編號松蕈菌絲球直徑測定結(jié)果 由圖1可知,不同編號松蕈菌絲球直徑由大到小依次為:松蕈2號>松蕈3號>松蕈4號>松蕈1號>松蕈5號>松蕈6號。其中松蕈2號菌絲球直徑和松蕈3號相差不大,分別為0.213 cm和0.208 cm。其他編號的松蕈菌絲球直徑均小于0.2 cm,對于液體發(fā)酵的菌絲球直徑一般要求在0.2 cm左右[9]。

圖1 不同編號菌株菌絲球直徑Fig.1 Different strains mycelium ball diameter

2.1.2 不同編號松蕈菌絲球數(shù)量的測定結(jié)果 100 mL發(fā)酵液中,不同編號松蕈菌絲球數(shù)量見圖2。由圖2可知,松蕈3號發(fā)酵液中菌絲球數(shù)量最多,達到了2900個,其次是松蕈2號,每100 mL發(fā)酵液中菌絲球數(shù)量為2880個。對于液體發(fā)酵的菌絲球數(shù)量要求在3000個/100 mL左右[9]。所以,基本能夠達到液態(tài)深層發(fā)酵要求的菌株是松蕈3號和松蕈2號。

圖2 不同編號菌株菌絲球數(shù)量Fig.2 Different strains mycelium ball numbers

2.1.3 不同編號松蕈菌絲體干重的測定結(jié)果 不同編號松蕈菌絲體干重如圖3所示,由圖3可知:松蕈2號菌絲體干重最大,為11.82 mg/mL,其次為松蕈3號,菌絲體干重為10.92 mg/mL,松蕈6號菌絲體干重最小。

圖3 不同編號菌株菌絲體干重 Fig.3 Different strains dry weight of mycelium

2.1.4 菌絲體日生長速率的測定結(jié)果 由圖4可見,2號和3號的菌絲體日均生長速率最快,2號菌絲體日生長速率為0.46 cm/d,特別是第10～12 d菌絲生長速率大幅度提升,這可能由于此培養(yǎng)基適合2號、3號菌絲體生長,前期可能因為培養(yǎng)基松緊影響,菌絲體處于穩(wěn)定生長時期,后期當培養(yǎng)基適宜菌絲體生長后,速率大幅度提升。

圖4 不同培養(yǎng)時間下的菌絲體日均生長速率Fig.4 Day of mycelium growth rate under different culture time

綜合菌絲球直徑、數(shù)量、干重及日生長速率的測定結(jié)果,松蕈2號3號的測定結(jié)果相近,但是松蕈2號發(fā)酵液菌絲體干重大于松蕈3號,所以,可初步判斷松蕈2號更適合液體發(fā)酵,本文選擇松蕈2號菌株作為進一步研究的實驗菌株。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素實驗

2.2.1 溫度對虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 保持酶活一個重要因素就是溫度,因此,在發(fā)酵過程中,選擇最佳的溫度條件,使得酶能維持其活性,才能使微生物生長保持在旺盛狀態(tài),得到最多的目的產(chǎn)物[10-11]。

不同發(fā)酵溫度對松蕈菌絲體產(chǎn)量的影響見圖5。

圖5 溫度對松蕈產(chǎn)菌絲體的影響Fig.5 Effect of temperature on the mycelia of Tricholoma matsutake

由圖可知,當發(fā)酵溫度為25 ℃時,松蕈菌絲體干重最大,為13.2 mg/mL。當溫度高于25 ℃時,松蕈菌絲體產(chǎn)量急劇下降,可能是松蕈菌絲體細胞生長代謝相關的酶耐熱性差,酶活降低導致。因此,選擇25 ℃作為最佳的發(fā)酵溫度。

2.2.2 搖床轉(zhuǎn)速對虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 當水中含有其他物質(zhì)的時候,氧在水中的溶解度就會降低。所以,在發(fā)酵的過程中,為滿足菌絲體生長代謝的需要,需要不斷的向培養(yǎng)液供給足夠的氧,但是,當溶氧過大的時候,菌絲體的生長代謝又會受到抑制,因此,為了提高代謝產(chǎn)物的濃度只能保持合適的溶氧[12]。通過搖床轉(zhuǎn)速可控制培養(yǎng)基中氧的含量。

搖床轉(zhuǎn)速對松蕈產(chǎn)菌絲體的影響見圖6。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對松蕈產(chǎn)菌絲體的影響Fig.6 Effect of shaking speed on the mycelia of Tricholoma matsutake

由圖6可知,搖床轉(zhuǎn)速對松蕈產(chǎn)菌絲體的影響比較明顯,當搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時,發(fā)酵液中菌絲體產(chǎn)量最高。轉(zhuǎn)速低時,由于通氣量小,培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧量不足,不能滿足菌絲體生長需求,而轉(zhuǎn)速過高對菌絲球的剪切作用增強,也不利于菌絲體的生長[13]。所以選擇160 r/min為最佳的搖床轉(zhuǎn)速。

2.2.3 發(fā)酵周期對虞山松蕈產(chǎn)菌絲體的影響 菌絲體的生長分為遲滯期,對數(shù)生長期,穩(wěn)定期及衰亡期四個時期。發(fā)酵周期對松蕈菌絲體產(chǎn)量的影響見圖7。

圖7 發(fā)酵周期對松蕈產(chǎn)菌絲體的影響Fig.7 Effect of fermentation cycle on the mycelia of Tricholoma matsutake

從發(fā)酵第2 d開始,菌絲生長進入了對數(shù)生長期,發(fā)酵第7 d,菌絲體產(chǎn)量接近最大,第8 d和第9 d時菌絲體產(chǎn)量相差不大。可能是由于培養(yǎng)過程中菌絲球直徑增大,導致營養(yǎng)物和溶解氧向內(nèi)部傳遞困難,菌絲體量不再增加。所以,選擇8 d作為發(fā)酵周期。

2.3 響應面實驗設計

響應面實驗設計及結(jié)果見表3。按照Design Expert 8.05 b軟件中的Box-Behnken Design方法,三個因素經(jīng)過擬合得到的回歸方程為:

菌絲體干重=13.42+0.12A+0.97B+1.60C-0.17AB+0.55AC+0.43BC-0.70A2-1.29B2-1.51C2

表3 Box-Behnken 實驗設計及相關結(jié)果

對該回歸方程進行方差分析,結(jié)果見表4。由表4可知,該模型達到極顯著水平(p=0.0005<0.01),該模型的R2=0.9575,說明該模型與實驗擬合良好,故可用于設計范圍內(nèi)的預測。

由表4可知,在一次項中,搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期對松蕈菌絲體干重的影響顯著(p<0.05),溫度對于松蕈菌絲體干重的影響不顯著。在二次項中,溫度、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期的影響都達到了顯著水平,交互項中,各因素的交互作用都不顯著。

根據(jù)Design Expert 8.05 b軟件對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,所得到的二次回歸方程的響應面圖如圖8～圖10所示,溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵周期及交互作用對響應值的影響可以從圖中直觀地反映出來,并確定各個因素的最佳水平。

表4 響應面實驗方差分析

圖8 溫度及搖床轉(zhuǎn)速對松蕈菌絲體交互效應的響應面圖Fig.8 Rsponse surface of the mycelia of Tricholoma matsutake vs fermentation temperature and rotation speed

圖9 溫度及發(fā)酵周期對松蕈菌絲體交互效應的響應面圖Fig.9 Response surface of the mycelia of Tricholoma matsutake vs fermentation temperature and fermentation cycle

通過分析預測得到松蕈菌絲體干重最大值為

圖10 搖床轉(zhuǎn)速及發(fā)酵周期對松蕈菌絲體交互效應的響應面圖Fig.10 Response surface of the mycelia of Tricholoma matsutake vs rotation speed and fermentation cycle

14.18 mg/mL,即當A(溫度)=25.3 ℃,B(搖床轉(zhuǎn)速)=169.4 r/min,C(發(fā)酵周期)=8.7 d?？紤]到實際操作便利,確定發(fā)酵條件的最佳組合為:溫度25 ℃,搖床轉(zhuǎn)速170 r/min,發(fā)酵周期8.5 d。為了證實預測的結(jié)果,用以上得到的最優(yōu)配方重復實驗3次,3次實驗菌絲體干重平均值為14.5 mg/mL,與預測值擬合較好,由此可以看出回歸方程為松蕈液體發(fā)酵提供了一個合適的模型。優(yōu)化后松蕈菌絲體產(chǎn)量與課題組前期優(yōu)化的白靈菇深層發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量接近,這說明液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)松蕈將指日可待[14]。

3 結(jié)論

以菌絲球直徑、菌絲球數(shù)量、菌絲體干重及菌絲體日生長速率為指標,篩選到液體發(fā)酵優(yōu)勢菌株為2號菌株,其菌絲球直徑為0.213 cm,每100 mL發(fā)酵液中菌絲球數(shù)量為2880個,菌絲體干重為11.82 mg/mL,菌絲體日生長速率為0.46 cm/d。

由單因素實驗可知,實驗菌株液體發(fā)酵最佳溫度為25 ℃,最佳搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min,最佳發(fā)酵周期為8 d。響應面實驗優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為溫度25 ℃,搖床轉(zhuǎn)速170 r/min,發(fā)酵周期8.5 d,在此條件下,松蕈菌絲體干重為14.5 mg/mL,比優(yōu)化前提高了23%。

本實驗首次對常熟虞山松蕈菌絲體深層液態(tài)發(fā)酵工藝進行了研究,實驗用培養(yǎng)基配方簡單、價格低廉、容易獲取,而且發(fā)酵周期短,菌絲體產(chǎn)量可觀,此研究對于生產(chǎn)實踐具有較好的指導作用。

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Predominant strains breeding and optimization of submerged fermentation conditions of Changshu YushanTricholomamatsutake

XU Bing,ZHENG Li-xue,WENG Yu-jie,JI Hong*

(College of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Strains breeding and optimization of submerged fermentation conditions of Changshu YushanTricholomamatsutakewere studied in this paper. The predominant strain ofTricholomamatsutakein liquid culture was screened by testing mycelium ball diameter,mycelium ball number,mycelium dry weight of the ball and day of mycelium growth rate under different incubation time. NO.2 was used as experimental strains. Mycelium submerged fermentation culture conditions were optimized. The effect temperature,shaking speed and fermentation cycle onTricholomamatsutakesubmerged fermentation were researched by single factor experiment. The optimal fermentation conditions determined by the response surface test was 25 ℃,170 r/min and 8.5 d,under which the dry weight of mycelium was 14.5 mg/mL.

Tricholomamatsutakeof Yushan;strains breeding;submerged fermentation;optimization

2015-01-26

徐兵(1982-)，男，碩士研究生，實驗師，研究方向：食用菌工程技術，E-mail：xubing@cslg.cn。

*通訊作者:冀宏(1969-)，男，博士研究生，研究員，研究方向：食用菌工程技術，E-mail：jihong@cslg.cn。

TS201.1

A

1002-0306(2015)21-0200-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.033