丁山

膠質(zhì)瘤是人體血管化程度最高的腫瘤，其具有高復(fù)發(fā)率的臨床特點(diǎn)，新生的血管不僅為腫瘤的生長提供營養(yǎng)支持，還構(gòu)成了腫瘤侵襲的途徑，單核細(xì)胞趨化因子MCP-1是CC趨化因子超家族重要成員，在腫瘤細(xì)胞中可高表達(dá)MCP-1及其受體CCR-2[1]。研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中CCR-2表達(dá)升高[2]。本研究提出膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能通過MCP-1/CCR-2途徑改變膠質(zhì)瘤血管生成的微環(huán)境，參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲，從而更好的解釋CCR-2在膠質(zhì)瘤血管生成中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞與儀器 試劑：膠質(zhì)瘤細(xì)胞系N9細(xì)胞（中國科學(xué)院細(xì)胞庫），含血清的完全培養(yǎng)基及不含血清培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），PCR試劑盒（上海碩盟生物），免疫組化試劑盒（武漢博士德），HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（上海碧云天生物），含EDTA的胰酶（美國GIBCO公司），一抗：VEGF、IL-8兔單克隆IgG和β-actin小鼠多克隆IgG（美國Santa Cruz公司）。儀器：細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)（蘇州凈化），培養(yǎng)箱（美國Queue systems），倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯），高轉(zhuǎn)速冷凍離心機(jī)（德國BiofugeStratos），-80℃ -4 ℃冰箱（日本松下），高壓消毒箱（美國Tuttnauer），轉(zhuǎn)膜儀及電泳儀（美國伯樂公司），PCR儀（澳大利亞Rotor-gene）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系N9細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃孵箱中傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4×106以上的時(shí)候進(jìn)行傳代，清洗培養(yǎng)基后，用含0.02% EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞回縮即終止消化，加入同體積的有血清培養(yǎng)基，吹打，5 min 10 000 r/min離心，棄上清，取細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種到新的培養(yǎng)瓶中。

1.3 CCR2活化 待細(xì)胞貼壁生長至4×106，對照組細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基，觀察組運(yùn)用MCP-1處理細(xì)胞，50 ng/mL MCP-1分別于0、12、24、36、48 h誘導(dǎo)活化，提取培養(yǎng)上清用于檢測VEGF、IL-8蛋白分泌情況，細(xì)胞用于提取RNA，以分析VEGF、IL-8 mRNA的表達(dá)。

1.4 免疫組化方法 采用SP檢測法，加入3%過氧化氫封閉阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，50 μL非免疫動(dòng)物血清封閉，加50 μL VEGF、IL-8一抗過夜，50 μL生物素標(biāo)記第二抗體，辣根過氧化物酶孵育，DBA顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠固封。結(jié)果判定：陽性細(xì)胞為細(xì)胞胞漿胞膜在倒置顯微鏡下出現(xiàn)深棕黃色的染色。

1.5 RT-PCR（半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）方法 提取總RNA。取2 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄cDNA，取20 μL作為反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)由逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ以及18sRNA和VEGF、IL-8的引物共同組成。反應(yīng)過程按照標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR步驟進(jìn)行：首先預(yù)變性的反應(yīng)條件為95 ℃、5 mins，接著進(jìn)行梯度變性反應(yīng)，共進(jìn)行30次的循環(huán)。接著對所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過拍攝電泳圖像對所得到的電泳結(jié)果進(jìn)行凝膠成像分析系統(tǒng)分析。內(nèi)參選擇18sRNA作為參照，同樣完成以上PCR系統(tǒng)的成像，對得到的半定量結(jié)果進(jìn)行對比分析，通過量化的吸光度積分值進(jìn)行分析（A值）。

1.6 Western blotting方法 提取上清蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，加VEGF、IL-8一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶1000）37 ℃孵育1 h。ECL光化學(xué)法顯色，用彩色圖像分析系統(tǒng)測定吸光度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有采集的數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。其中對符合正態(tài)分布資料的數(shù)據(jù)采用（±s）表示，對非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距來表示。遵循正態(tài)分布而且方差齊性，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。非參數(shù)檢驗(yàn)法對不同時(shí)間所表達(dá)的mRNA的量和蛋白的量進(jìn)行比較，應(yīng)用Kruskal-wallis H檢驗(yàn)進(jìn)行多組間數(shù)據(jù)的比較，應(yīng)用Mann-whitney U檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的以P<0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測CCR-2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系N9細(xì)胞中表達(dá)情況 取5張片，每張片取5個(gè)視野，取平均值。陽性表達(dá)以細(xì)胞核著色為主，其陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：<5%計(jì)為0分，6%~25%計(jì)為1分，26%~50%計(jì)為2分，51%~75%計(jì)為3分，>75%計(jì)為4分；染色的著色評(píng)分：不著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。最后的結(jié)果評(píng)判陽性率和著色的強(qiáng)弱相加之和為總得分，0分的計(jì)為陰性組“-”，1~2分的計(jì)為弱陽性組“+”，3~4分的計(jì)為陽性組“++”，5~7分的計(jì)為強(qiáng)陽性組“+++”。CCR-2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系N9細(xì)胞中有較高的陽性表達(dá)，共46個(gè)細(xì)胞，-4個(gè)，+15個(gè)，++17個(gè)，+++10個(gè)，占91.30%。

2.2 RT-PCR檢 測MCP-1活 化CCR2后VEGF和IL-8mRNA表達(dá)水平 經(jīng)過活化之后可以增加N9細(xì)胞的VEGF和IL-8mRNA表達(dá)水平，與未活化組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 通過Western blot法檢測MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8的蛋白表達(dá)水平 經(jīng)過活化之后可以增加N9細(xì)胞的VEGF和IL-8蛋白表達(dá)水平，與未活化組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表1 RT-PCR檢測MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8mRNA表達(dá)水平（x-±s）

表2 Western blot法檢測MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8的蛋白表達(dá)水平（x-±s）

3 討論

膠質(zhì)瘤是人體血管瘤中一種復(fù)發(fā)率較高的腫瘤，以新生血管的快速增長為主要病理特征，新生血管不僅給腫瘤提供營養(yǎng)支持還可以構(gòu)成腫瘤外周組織侵襲的途徑[3]。單核細(xì)胞趨化蛋白1-MCP-1是CC趨化因子超家族的主要成員，其受體為CCR2。已有研究表明兩者與腫瘤細(xì)胞浸潤有著密切的關(guān)系[4]。膠質(zhì)瘤患者的腦脊液中存在MCP-1及CCR2的高表達(dá)，過表達(dá)CCR2還存在于膠質(zhì)瘤祖細(xì)胞中，因此本研究通過探討單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）受體CCR-2在膠質(zhì)瘤血管生成中的作用，為更好的研究其在腫瘤復(fù)發(fā)中的機(jī)制。

血管的生成在腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲中發(fā)揮著重要的作用，但是其始動(dòng)細(xì)胞一直是腫瘤血管生成的關(guān)鍵科學(xué)問題[5]。VEGF和IL-8是兩種重要的促進(jìn)血管生成因子，可直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體，發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞生成、增殖及遷移的作用[6]。本研究結(jié)果顯示，CCR-2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系N9細(xì)胞中有較高的陽性表達(dá)，經(jīng)過活化之后可以增加N9細(xì)胞的VEGF和IL-8mRNA及蛋白表達(dá)水平，與未活化組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究提示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CCR2活化可以促進(jìn)血管內(nèi)皮因子及白細(xì)胞介素-8的表達(dá)，進(jìn)而具有促進(jìn)血管生成的作用。膠質(zhì)瘤形成是CCR2通過MCP-1活化發(fā)揮血管生成作用的。

綜上所述，膠質(zhì)瘤的生成中促血管生成因子之間的調(diào)控是關(guān)鍵因素，在今后的抗腫瘤藥物研發(fā)方面應(yīng)將促血管生成因子考慮到其中，更有效地抑制血管地生成，更好地發(fā)揮對腫瘤生長發(fā)展和遷移的抑制作用。

[1] Jiao B， Wang Y S， Cheng Y N， et al. Valsartan attenuated oxidative stress， decreased MCP-1 and TGF-beta1 expression in glomerular mesangial and epithelial cells induced by high-glucose levels[J]. Biosci Trends，2011，5（4）：173-181.

[2] Izhak L， Wildbaum G， Jung S， et al. Dissecting the autocrine and paracrine roles of the CCR2-CCL2 axis in tumor survival and angiogenesis[J]. PLoS One，2012，7（1）：e283 05.

[3] Suresh N M， Saafan Z M， Nicolas C R， et al. Role of monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1/CCL2） in migration of neural progenitor cells toward glial tumors[J]. J Neuro Res，2009，87（7）：1547-1555.

[4] Dutra R C， Claudino R F， Bento A F， et al. Preventive and therapeutic euphol treatment attenuates experimental colitis in mice[J]. PLoS One，2011，6（11）：e271 22.

[5] Wang K， Niu J， Kim H， et al. Osteoclast precursor differentiation by MCPIP via oxidative stress， endoplasmic reticulum stress， and autophagy[J]. J Mol Cell Biol，2011，3（21）：360-368.

[6] Bhardwaj S， Roy H， Babu M， et al. Adventitial gene transfer of VEGFR-2 specific VEGF-E chimera induces MCP-1 expression in vascular smooth muscle cells and enhances neointimal formation[J].Atherosclerosis，2011，219（123）：84-91.