應(yīng)春妹， 張紅菊， 唐振華， 陳慧芬， 高 晶， 蔣南燕

·論著·

上海3所婦產(chǎn)科醫(yī)院白念珠菌基因同源性分析

應(yīng)春妹1， 張紅菊1， 唐振華2， 陳慧芬3， 高 晶1， 蔣南燕1

目的 了解上海地區(qū)白念珠菌主要基因型，為監(jiān)測(cè)和診治臨床白念珠菌感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 收集2013年11月—2014年1月復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院、國(guó)際和平婦幼保健院和上海市第一婦嬰保健院3所醫(yī)院陰道炎患者陰道分泌物分離的白念珠菌共115株，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA檢測(cè)其基因型，ATB FUNGUS 3試劑盒檢測(cè)5種抗真菌藥物最低抑菌濃度。結(jié)果 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA結(jié)果顯示，115株菌分為A、B、C 3型，其中A型89株(占77.4%)又分5個(gè)亞型，B型22株(占19.1%)分為2個(gè)亞型。C型4株(占3.5%)。115株白念珠菌對(duì)5-氟胞嘧啶敏感率為96.5%；對(duì)兩性霉素B敏感率為100%；對(duì)氟康唑敏感率為85.2%；對(duì)伊曲康唑敏感率為55.7%；對(duì)伏立康唑敏感率為84.3%。結(jié)論 上海地區(qū)3所醫(yī)院分離的白念珠菌基因型沒(méi)有明顯區(qū)別, 同源性分型主要以A型為主。藥敏試驗(yàn)顯示，該地區(qū)白念珠菌對(duì)5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伏立康唑敏感率較高。

白念珠菌； 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA； 同源性分析

念珠菌性陰道病是一種常見(jiàn)的婦科疾病，是局部黏膜念珠菌過(guò)度生長(zhǎng)致菌群生態(tài)紊亂引起。國(guó)內(nèi)外的流行病學(xué)研究表明，念珠菌是繼細(xì)菌之后引起婦女陰道炎的主要病原真菌，其中80%～95%系由白念珠菌引起[1]。本研究應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD),對(duì)上海復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院、國(guó)際和平婦幼保健院和上海市第一婦嬰保健院3所婦產(chǎn)科專(zhuān)科醫(yī)院分離的白念珠菌進(jìn)行基因分型，以了解上海地區(qū)白念珠菌主要基因型，為監(jiān)測(cè)和診治臨床白念珠菌感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2013年11月—2014年1月分離的115株白念珠菌，其中復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院59株、國(guó)際和平婦幼保健院30株和上海市第一婦嬰保健院26株，均為陰道炎患者陰道分泌物標(biāo)本中分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 科瑪嘉顯色平皿(上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司)。酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium，YPD，上海生工科技有限公司)。

1.1.3 試劑盒 酵母樣真菌藥敏試劑盒(ATB FUNGUS 3，法國(guó)生物梅里埃公司)。DNA抽提試劑盒(BioFlux公司)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 白念珠菌鑒定與保存 標(biāo)本收集后立即接種于YPD瓊脂平皿和科瑪嘉顯色平皿，置35 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)24～48 h后，YPD瓊脂平皿上，菌落呈奶酪色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，科瑪嘉顯色平皿上呈翠綠色。涂片鏡檢，見(jiàn)鏡下圓形或卵圓形菌體或孢子及假菌絲，則鑒定為白念珠菌。菌株保存于YPD液體培養(yǎng)基，-80 ℃保存。

1.2.2 白念珠菌 DNA提取 按DNA提取試劑盒操作(BioFlux公司)。該試劑盒以選擇性Biospin膜系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過(guò)多個(gè)步驟的沉淀和重懸提取DNA，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)量核酸濃度。

1.2.3 RAPD檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)所需引物為99407(5′-ACG GCC GAC C-3′)[2-3]。50 μL反應(yīng)體系包括：5 u/μL Taq酶(TaKaRa公司)0.25 μL，無(wú)Mg2+的10×PCR緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3; 500 mmol/L KCl)5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，dNTP混合物(各2.5 mmol/L)4 μL，10 μmol/L的引物4 μL，模板DNA 1 μL和32.75 μL雙蒸水。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 2 min，36 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)40次；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物，1 %瓊脂糖凝膠電泳25 min。

1.2.4 抗真菌藥敏試驗(yàn) 挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，用ATB FUNGUS 3試劑盒鑒定。該試劑盒包括5種抗真菌藥物：5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑。質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258。藥敏結(jié)果按照CLSI M27-A3折點(diǎn)判斷[4]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用NTsys 2.10e軟件包實(shí)現(xiàn)條帶結(jié)果的聚類(lèi)分析，在相似系數(shù)0.80水平進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 RAPD檢測(cè)結(jié)果

115株菌分為A、B、C 3型，其中A型89株，占77.4%，又分5個(gè)亞型；B型22株，占19.1%，分為2個(gè)亞型；C型4株，占 3.5%。白念珠菌RAPD指紋圖見(jiàn)圖1。3所醫(yī)院分型結(jié)果如下：復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院59株白念珠菌中A型45株(包括A1A5型)、B型10株(B1、B2型)、C型4株；國(guó)際和平婦幼保健院30株白念珠菌中A型23株(包括A1A4型)，B型7株(B1、B2型)；上海市第一婦嬰保健院26株白念珠菌中A型21株(包括A1A3型、A5型)，B型5株(B1、B2型)，見(jiàn)表1。

M: DNA Marker; T1-T8:Candidaalbicansstrains

圖1 白念珠菌RAPD指紋圖

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)CLSI M27-A3判斷標(biāo)準(zhǔn)，5種抗真菌藥物最低抑菌濃度(MIC)折點(diǎn)范圍見(jiàn)表2。115株白念珠菌對(duì)5-氟胞嘧啶敏感率為96.5%，對(duì)兩性霉素B敏感率為100%，對(duì)氟康唑敏感率為85.2%，對(duì)伊曲康唑敏感率為55.7%，對(duì)伏立康唑敏感率為84.3%，見(jiàn)表3。

表2 5種抗真菌藥物MIC折點(diǎn)范圍

表3 115株白念珠菌對(duì)5種抗真菌藥物敏感率

3 討論

本研究通過(guò)RAPD檢測(cè)及聚類(lèi)分析將115株白念珠菌分為A、B、C 3型，其中A型又分5個(gè)亞型，B型分為2個(gè)亞型，以A型為主，占77.4%。3所婦產(chǎn)科醫(yī)院分型較一致，均以A型為主，C型僅在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院分離到，其他2所醫(yī)院未見(jiàn)C型，說(shuō)明上海地區(qū)白念珠菌主要以A型為主。項(xiàng)明潔等[3]臨床分離并保存的120株白念珠菌進(jìn)行RAPD基因分型，選用引物99407，結(jié)果可分為8 型：28株菌為A型，37株菌為B型，21株菌為C型，6株菌為D型，25株菌為E型，3株菌各成一型，分別為O1、O2、O3型。從醫(yī)院水平未發(fā)現(xiàn)型別分布呈明顯傾向性，而在醫(yī)院的病區(qū)型別分析中，發(fā)現(xiàn)血液科主要為A 和C 型，肺科主要為A、B 和E 型。從南京市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科和中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所門(mén)診收集并分離陰道分泌物標(biāo)本的97株念珠菌中，85.6%為白念菌株。RAPD擴(kuò)增結(jié)果表明，引物4和引物7均可將來(lái)源于不同臨床分型的97株菌及2株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別分成19型和21型。其中應(yīng)用引物4的主要分型結(jié)果為A1型20株，B1型20株，C1型23株；其中應(yīng)用引物7的主要分型結(jié)果為A2型52株，B2型7株，C2型9株，以A2型為主[5]。從巴西東北部患念珠菌性陰道病婦女陰道分泌物中分離得到的62株白念珠菌，用RAPD法進(jìn)行基因分型，A型最為普遍，占93.6%，其次是C型，占6.4%，而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)B型[6]。在泰國(guó)艾滋病患者分離得到的白念珠菌，用RAPD法進(jìn)行分型，將87株白念珠菌分成了14型，主要集中在10個(gè)型中，說(shuō)明泰國(guó)的白念珠菌有著豐富的多樣性[7]。

念珠菌基因分型主要有RAPD檢測(cè)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、多位點(diǎn)序列分型和單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析等方法。脈沖場(chǎng)凝膠電泳雖是念珠菌基因分型金標(biāo)準(zhǔn)方法，但因其操作煩瑣，研究人員需掌握一定的分子檢測(cè)技術(shù)，在臨床較少使用。多位點(diǎn)序列分型是近年來(lái)發(fā)展的新的分子生物學(xué)分型方法，通過(guò)分析多個(gè)管家基因內(nèi)部片段的核苷酸序列對(duì)病原菌進(jìn)行基因分型，通過(guò)多位點(diǎn)序列分型數(shù)據(jù)庫(kù)能對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室及不同國(guó)家的分析結(jié)果進(jìn)行比較[8]。RAPD檢測(cè)的分型結(jié)果可因不同引物或選取不同的相似系數(shù)而產(chǎn)生不同的分型結(jié)果，如Noumi等[2]的研究以相似系數(shù)75%水平為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型，將25株白念珠菌分成Ⅰ、Ⅱ 2型，其中Ⅱ型又分成A、B 2型。Ben Abdeljelil 等[9]使用RAPD方法研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同水平相似系數(shù)下所分型別也有所不同，在相似系數(shù)為69%水平分型時(shí)，90株白念珠菌分成Ⅰ、Ⅱ 2型；在相似系數(shù)為100%水平時(shí)，可分成29個(gè)型，其中84.8%集中在15個(gè)型中。但該方法檢測(cè)分型能力強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速、成本較低，在念珠菌基因分型中應(yīng)用較廣[10-11]，對(duì)監(jiān)測(cè)白念珠菌的醫(yī)院感染來(lái)源以及流行病學(xué)調(diào)查方面依然是較實(shí)用的檢測(cè)方法。

白念珠菌是引起婦女陰道炎的主要病原之一，念珠菌性陰道病廣泛影響著育齡期婦女的健康。對(duì)白念珠菌的耐藥性進(jìn)行分析，能夠指導(dǎo)臨床用藥。唑類(lèi)抗真菌藥物是念珠菌病治療的常規(guī)用藥，與兩性霉素B相比，毒性及不良反應(yīng)小。本實(shí)驗(yàn)對(duì)115株白念珠菌作體外藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示白念珠菌對(duì)兩性霉素B敏感率為100%，對(duì)5-氟胞嘧啶敏感率為96.5%，對(duì)唑類(lèi)抗真菌藥物的敏感率也較高，其中氟康唑和伏立康唑敏感率均在85%左右，在臨床上仍有良好應(yīng)用前景。

本研究應(yīng)用RAPD分型方法檢測(cè)了3所婦產(chǎn)科專(zhuān)科醫(yī)院115株白念珠菌基因型，對(duì)了解上海地區(qū)白念珠菌分子流行病學(xué)特征具有重要意義，為臨床白念珠菌監(jiān)測(cè)和診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Homology analysis of theCandidaalbicansstrains collected from three Obstetrics and Gynecology Hospitals in Shanghai by genotyping

YING Chunmei, ZHANG Hongju, TANG Zhenhua, CHEN Huifeng, GAO Jing, JIANG Nanyan

. (Department of Laboratory Medicine, Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China)

Objective To investigate the genotypes and susceptibility ofC.albicansstrains isolated from Obstetrics and Gynecology Hospitals in Shanghai. Methods A total of 115 clinical isolates ofC.albicanswere collected from Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, International Peace Maternity and Child Health Hospital and Shanghai First Maternity and Infant Hospital during the period from November 2013 to January 2014. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) was used for genotyping ofC.albicansisolates. Clustering analysis was undertaken using NTsys 2.10e software package. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of 5 antifungal agents were determined by ATB FUNGUS 3 (Biomérieux). Results All the strains tested were grouped into type A, B or C by RAPD. There were 5 subtypes in type A and 2 subtypes in type B. Of the 115C.albicansstrains, 96.5%, 100%, 85.2%, 84.3% and 55.7% were susceptible to 5-flucytosine, amphotericin B, fluconazole, voriconazole and itraconazole, respectively. Conclusions TheC.albicansisolates collected from Obstetrics and Gynecology Hospitals in Shanghai during the period from November 2013 to January 2014 are still highly susceptible to 5-flucytosine, amphotericin B, fluconazole and voriconazole. RAPD genotypes ofC.albicansisolates did not show significant difference among the three hospitals.

Candidaalbicans; random amplified polymorphic DNA; gene homology

上海申康醫(yī)院發(fā)展中心市級(jí)醫(yī)院臨床輔助科室能力建設(shè)項(xiàng)目(SHDC22014016)。

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200011； 2. 國(guó)際和平婦幼保健院； 3. 上海市第一婦嬰保健院。

應(yīng)春妹(1967—)，女，碩士，主任技師，主要從事細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)和耐藥機(jī)制研究。

應(yīng)春妹，E-mail:ycmzh2012@163.com。

R379.4

A

1009-7708(2015)04-0345-04

2014-08-20

2015-02-10