摘要：為了解蕎麥芽中還原型谷胱甘肽（GSH）的含量，本實(shí)驗(yàn)以蕎麥芽為原料，采用5，5′二硫硝基苯甲酸（DTNB）衍生化試劑，利用分光光度法進(jìn)行了定量分析。DTNB衍生化法采用分光光度法在高吸收峰中用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算蕎麥芽中的GSH，得其含量范圍達(dá)（1.3142±0.0058）毫克/克，是目前所測(cè)植物樣品中GSH含量較多的物種。每克蕎麥芽粉中GSH 提取量達(dá)0.8132毫克。

關(guān)鍵詞：DTNB; 蕎麥芽;GSH

中圖分類(lèi)號(hào)： R927.2 " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： "A " " " " " " " " " " DOI編號(hào)： " 10.14025/j.cnki.jlny.2015.22.045

谷胱甘肽及其衍生物作為人體內(nèi)重要的自由基清除劑和抗氧化劑，如果與自由基、重金屬等結(jié)合，就可以把機(jī)體內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，排泄出體外，從而具有解毒、保護(hù)損傷器官、保護(hù)肝臟、防輻射、增強(qiáng)免疫力、防止皮膚老化及色素沉著、美容、改善缺氧癥、治療眼科疾病、抗過(guò)敏、抑制艾滋病等多種功能[1]。還原性谷胱甘肽在谷物種子、胚芽、酵母以及人體和動(dòng)物的心臟、肝臟等器官中含量較高[2]。在東北地區(qū)有藥食同源的蕎麥，在朝鮮族傳統(tǒng)美食冷面和《朝藥志》、《朝藥錄》等中均有用武之地。因此，本實(shí)驗(yàn)決定采用蕎麥芽來(lái)做實(shí)驗(yàn)樣品。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 蕎麥 實(shí)驗(yàn)原材料蕎麥選于延吉市西市場(chǎng)，并自行發(fā)芽。

1.1.2 試劑與藥品 5，5-二疏基-2，2-二硝基苯甲酸/DTNB（上海源葉生物科技有限公司）;還原型谷胱甘肽（上海源葉生物科技有限公司）;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、正丁醇、乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;以上均為分析純。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 FA1004 電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）;DHG-907385-Ⅲ 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）;MA45C 水分測(cè)定儀（上海賽多利斯儀器有限公司）; KQ-500DE型 醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）;TDL-5000B 冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;PHS-3C pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）;DZF-6050型 真空干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）;UV-1800紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）;索式提取器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理工藝流程 "帶殼蕎麥→挑選→清洗→發(fā)芽→擇優(yōu)采摘→清洗→烘干→研磨→篩分→脫脂→低溫保存待用。

1.2.2 預(yù)處理 選擇延吉市西市場(chǎng)新鮮、充實(shí)飽滿(mǎn)、無(wú)蟲(chóng)蛀、帶殼蕎麥，經(jīng)挑選、清洗后進(jìn)行12小時(shí)的浸泡，保證避光條件，浸泡操作完成后，再清洗干凈并平鋪于透明的塑料盆并蓋上濕毛巾，每盆平鋪高度不超過(guò)3厘米。第1～2天每隔12個(gè)小時(shí)重復(fù)上述浸泡后的操作并保持光照和通風(fēng)，之后則每隔8小時(shí)重復(fù)上述操作并保持光照和通風(fēng)，溫度為室溫，保持在15℃～18℃，濕度則保持每次清洗樣品后倒出多余的水使表面自然附著水分即可，發(fā)芽時(shí)間大約為5～6天，芽的長(zhǎng)度控制在2～4厘米，并確保有95%的出芽率。

發(fā)芽操作完成后，以顏色為米白色、光滑、飽滿(mǎn)和直的蕎麥芽為基準(zhǔn)進(jìn)行選摘，用清水沖洗干凈后，放入烘干箱內(nèi)，烘干箱溫度調(diào)至50℃，烘干至水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%以下。取烘干后的蕎麥芽進(jìn)行研磨使其粒度達(dá)到80目，再用索式提取器脫脂12小時(shí)，脫脂處理后放入低溫條件下，以保存待用。

1.2.3 DTNB法 5，5-二疏基-2，2-二硝基苯甲酸（DTNB）衍生化試劑在λ=323nm處吸收峰強(qiáng)，且當(dāng)溶液中加入的DTNB為GSH的1/2時(shí)，DTNB在λ=323nm處的吸收峰消失而同時(shí)在λ=409nm處生成新的吸收峰。這說(shuō)明GSH的疏基與DTNB發(fā)生作用后其衍生化產(chǎn)物，3-羧基-4-硝基苯硫酚在可見(jiàn)區(qū)吸收強(qiáng)。從而可以確定在409nm處檢測(cè)到的吸收峰為還原性谷胱甘肽與DTNB衍生化物[13]。DTNB衍生化法是細(xì)胞破碎與衍生化反應(yīng)同步反應(yīng)測(cè)定，使GSH不易變性，更為穩(wěn)定，測(cè)定定性及定量分析的數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確完整，利于研究者們分析探究，是可靠的分析手段。

故GSH的定量分析是基于DTNB和疏基化合物衍生化反應(yīng)定量生成3-羧基-4-硝基苯硫酚的顯色反應(yīng)，可以利用分光光度法測(cè)定GSH的含量。

具體操作方法：取25毫升含有2×10-5 摩爾/升 DTNB的0.02摩爾/升 PBS緩沖液（pH7.00）作為提取液，加入0.25春蕎麥芽粉，并進(jìn)行超聲波震蕩破壁、工藝條件：500W，30 分鐘，離心取10毫升上清液，加入其2倍體積乙醇溶液、放置30 分鐘，而后在4980轉(zhuǎn)/ 分鐘轉(zhuǎn)速下離心8 分鐘除蛋白，為降低誤差。取離心后上清液，真空濃縮至10毫升，調(diào)節(jié)酸度至pH7.00，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品中的GSH進(jìn)行分析[3]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：在6組（0毫升，0.2毫升，0.4毫升，0.6毫升，0.8毫升，1.0毫升）4×10-5 mol/L的GSH中分別對(duì)應(yīng)加入 6組（1.0毫升，0.8毫升，0.6毫升，0.4毫升，0.2毫升，0毫升）25毫升含有2×10-5 摩爾/升 DTNB的0.02摩爾/升 PBS緩沖液（pH7.00），充分混勻后，真空濃縮至10毫升，再調(diào)節(jié)pH至7.00，在409nm下測(cè)定強(qiáng)吸收峰的λ值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在過(guò)量的DTNB溶液中最大吸收波長(zhǎng)處的吸收強(qiáng)度與加入的GSH濃度呈良好的線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中GSH的定量分析是根據(jù)疏基與DTNB在pH為7.00的溶液中產(chǎn)生反應(yīng)，生成3-羧基-4-硝基苯硫酚，其離子呈黃色且在實(shí)驗(yàn)中在409 nm處具有強(qiáng)吸收。

圖1 pH7.00在409 nm的標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)圖1可以得出在pH7.00時(shí)的線性回歸方程為y = 0.143x + 0.010，R2 = 0.998 。

2.2 實(shí)際樣品的分析

表1 樣品在409 nm中檢測(cè)到的吸光值

根據(jù)圖1，在pH7.00時(shí)的線性回歸方程為y=0.143x+ 0.010，R2=0.998 兌入實(shí)驗(yàn)樣品得出數(shù)值0.398，得出x=2.7133

根據(jù)計(jì)算公式m=M×n×V

M-溶質(zhì)的摩爾質(zhì)量

n-樣品中GSH的濃度

V-溶質(zhì)體積

m-樣品中GSH的質(zhì)量

可知在pH7.00的環(huán)境下可測(cè)出樣品中GSH的濃度為2.7133×10-5摩爾/升，故可以推算出其中還原性谷胱甘肽含量為1.314毫克/克。在植物中檢測(cè)出的還原性谷胱甘肽含量處于中上水平，最高是在小麥胚芽中檢測(cè)出的[4]，其數(shù)值達(dá)到1.8071毫克/克。

3 討論分析

蕎麥芽是目前已測(cè)出的植物中的谷胱甘肽含量較多的物種，達(dá)到1.3142毫克/克。為將來(lái)工業(yè)化提取谷胱甘肽提供了理論基礎(chǔ)，另外由于蕎麥芽市場(chǎng)價(jià)不高，地區(qū)產(chǎn)量多，同時(shí)又有飲食文化的優(yōu)勢(shì)，蕎麥芽作為健康食品有著十分廣闊的推廣前景。

參考文獻(xiàn)

[1]楊培慧，齊建英，馮德雄，等.谷胱甘肽的應(yīng)用及其監(jiān)測(cè)方法[J].中國(guó)生化藥物雜志，2002，23（01）：52-54.

[2]鄭建仙.功能性食品[M].中國(guó)輕工業(yè)出版社，1995.

[3]朱亞玲，張小勇，崔勝云.利用衍生化試劑DTNB測(cè)定枸杞中谷胱甘肽[J].食品科學(xué)，2010，32（06）：250-255.

[4]劉千，陳黎，胡用軍，等.麥胚谷胱甘肽提取與含量測(cè)定方法[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2012，27（10）：104-108.

作者簡(jiǎn)介：張娜，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，本科生在讀，研究方向：食品分析。

通訊作者：李鉉軍，碩士，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，講師，研究方向：食品分析。