（信陽農(nóng)林學(xué)院生物技術(shù)系，河南 信陽 464300）

摘 要：建立了RP-HPLC法測(cè)定芍藥籽中單萜苷類含量的方法。芍藥苷等單萜苷類物質(zhì)具有較好的生物活性，目前，芍藥中的單萜苷目前主要來源于芍藥的根，分析結(jié)果表明，芍藥籽仁中也含有較多的單萜苷，這些單萜苷也可以作為另一個(gè)重要的單萜苷來源。

關(guān)鍵詞：RP-HPLC法;單萜苷;含量測(cè)定

0 引言

芍藥屬毛茛科，雙子葉植物綱，為灌木或多年生草本植物。芍藥是多年生宿根草本，具紡錘形肉質(zhì)根。芍藥苷是芍藥中提取的主要活性成分，具有解痙鎮(zhèn)痛和改善記憶、抗自由基損傷等功能和抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、抗KA神經(jīng)病變的生理功能。

單萜苷類化合物是天然藥物中一類重要的化學(xué)成分，在植物中廣泛分布，是許多常用中藥的有效成分，如芍藥、牡丹、花椒等。主要有無環(huán)、單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)單萜苷和環(huán)烯醚萜苷等多種結(jié)構(gòu)類型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）籽：采自河南省孟津縣土橋村花木公司基地，原植物及樣品由該公司總經(jīng)理衛(wèi)志鵬老師鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：

儀器： Agilent1100高效液相色譜儀（安捷倫公司）;SENCO W201恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）; FA2004電子天平（天津市天分分析儀器廠） ;YXJ-A高速大容量電動(dòng)離心機(jī)（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）; SB-2A型紫外分光光度計(jì)（天津市天分分析儀器廠）;100 mL容量瓶、1 mL/5 mL移液管、50 mL/100 mL量筒、40 mL/50 mL/80 mL燒杯、100 mL圓底燒瓶等玻璃儀器均來自四川蜀牛玻璃儀器廠;0-100酒精計(jì)（河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠）;試劑：磷酸，分析純;乙腈，色譜純;甲醇，色譜純;磷酸二氫鉀，色譜純;二次蒸餾水，自制;對(duì)照品：4′′-羥基白芍苷，氧化芍藥苷，白芍苷，芍藥苷，paeonidanin和白芍苷R1等均為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)NMR和 ESI-MS鑒定了化合物的結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC測(cè)定純度大于98%。

2 實(shí)驗(yàn)條件

2.1 色譜條件

Agilent1100高效液相色譜儀;色譜柱：Zorbax SB-Aq C18色譜柱（4.6×250 mm，5μm）;流動(dòng)相：乙腈-磷酸（0.05），或乙腈-磷酸二氫鉀緩沖鹽（pH=3.0）;體積流量為1.0 mL· min-1;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品4′′-羥基白芍苷10.3 mg，氧化芍藥苷10.4 mg，白芍苷10.8 mg，芍藥苷18.6 mg，paeonidanin 14.9 mg，白芍苷R1 8.1 mg，用甲醇定容于50 mL容量瓶中，配成濃度為206 μg·mL-1， 208 μg·mL-1， 216 μg·mL-1， 372 μg·mL-1， 298 μg·mL-1， 161 μg·mL-1的混合溶液，即為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取采集的芍藥種子，脫殼機(jī)脫殼，收集芍藥籽仁和籽殼，將籽仁和籽殼置于100℃的烘箱中烘3h。將經(jīng)過烘干的芍藥籽殼和籽餅粕粉碎，過60目篩，分別精密稱取10.00克樣品，用濾紙包好，加入100mL甲醇為提取溶劑，采用索氏提取器回流提取4h?；厥仗崛∫?，冷卻后，濾液用0.45μm的微孔濾膜過濾，定容于100mL容量瓶中，即為供試品溶液。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 吸收紫外波長的選擇

采用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)制備的6個(gè)單萜苷標(biāo)樣溶液在波長200～400 nm間掃描進(jìn)行全波長掃描?？梢钥闯?′′-羥基白芍苷和氧化芍藥苷在260 nm處有明顯的吸收峰，白芍苷，芍藥苷，paeonidanin和白芍苷R1在232 nm處有最大吸收峰。因此，本測(cè)定方法的吸收波長采用變波長法測(cè)定，根據(jù)保留時(shí)間，測(cè)定4′′-羥基白芍苷和氧化芍藥苷時(shí)選擇260 nm波長，測(cè)試白芍苷，芍藥苷，paeonidanin和白芍苷R1等時(shí)選擇測(cè)定波長為232 nm。所以HPLC的檢測(cè)波長為（0～7.5 min） 260 nm， （7.5～22 min） 232 nm。

3.2 洗脫流動(dòng)相的選擇

由于單萜苷類化合物含有較多的羥基，這些羥基與固定相作用較強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致拖尾。所以文獻(xiàn)報(bào)道分離芍藥苷等單萜苷類的流動(dòng)相多為乙腈-磷酸水體系[1-3]。本文優(yōu)化了乙腈-磷酸水體系作為分離流動(dòng)相的分離效果。發(fā)現(xiàn)僅僅乙腈-磷酸水體系難以實(shí)現(xiàn)對(duì)4′′-羥基白芍苷和氧化芍藥苷兩種單萜苷的分離。我們參考苷類分離方法的文獻(xiàn)[4]報(bào)道，對(duì)乙腈-磷酸二氫鉀緩沖鹽體系對(duì)單萜苷類的分離體系進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇乙腈-磷酸二氫鉀緩沖鹽（pH=3.0）為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。分離洗脫條件為：梯度洗脫，梯度為0 min（A， 15%）→10min（A， 15%）→22min（A， 25%）。在此條件下，各個(gè)單萜苷都得到很好的分離，并且分析時(shí)間較短。

3.3 供試品的制備方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙醇和乙腈等溶劑提取單萜苷的效率，同時(shí)對(duì)不同的提取方法（超聲、索氏回流、冷浸，回流）、提取時(shí)間、料液比及溶劑濃度進(jìn)行了優(yōu)化，以其中主要成分芍藥苷的含量作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用10倍量的甲醇和乙腈用索氏提取器回流4h時(shí)芍藥苷的得率比較接近，大于用其它提取方法得到的得率。但乙腈毒性較大，綜合評(píng)價(jià)得率和安全性等因素，最后選擇甲醇作為提取溶劑。

3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL加入到10 mL容量瓶中，用甲醇定容。然后吸取0.75 μL、1.5 μL、3 μL、6 μL、12 μL注入色譜儀，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得4′′-羥基白芍苷，氧化芍藥苷，白芍苷，芍藥苷，paeonidanin和白芍苷R1的線性回歸方程見表1。

3.5 樣品含量的測(cè)定

將經(jīng)過烘干的芍藥籽仁和籽殼用高速粉碎機(jī)粉碎，過60目篩。按照“1.6”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液。精密吸取對(duì)照品混合物和供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，照上述色譜條件分別測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算不同部位中各個(gè)組分的含量，結(jié)果見表2。

4 試驗(yàn)結(jié)論

建立了RP-HPLC法測(cè)定芍藥籽中單萜苷類含量的方法，分析結(jié)果表明，芍藥籽中的單萜苷類成分具有較好的生物活性，其在芍藥籽殼中含量相對(duì)較少，主要存在于芍藥籽仁中。以后芍藥籽仁可以作為除了芍藥的根以外的另一個(gè)重要的單萜苷來源。

另外，分析測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在芍藥籽餅粕中還有其它的一些單萜苷類化合物存在，這些物質(zhì)目前并沒有被分離得到，進(jìn)一步研究這些化合物的結(jié)構(gòu)對(duì)于芍藥籽餅粕深入研究開發(fā)具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]李偉銘，趙月然，楊燕云. HPLC波長切換法同時(shí)測(cè)定白芍飲品中9種成分的含量[J].藥物分析雜志，2011，31（12）：2208-2212.

[2]劉普，李亮，鄧瑞雪. 鳳丹籽餅粕單萜苷類成分的研究[J].中國藥學(xué)雜志，2013，48（17）：1445-1448.

作者簡(jiǎn)介：羅婧（1983-），女，碩士，講師，研究方向：食品油脂化學(xué)。