摘要：采用刺探電位圖（EPG）技術監(jiān)測褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）對人工取食液的取食行為，參考褐飛虱取食水稻的EPG波形，對褐飛虱取食Parafilm膜下液體狀物質的EPG波形進行解析，發(fā)現褐飛虱在液體飼喂模型中產生5種典型波形，分別為非刺探波形（np波）、口針刺入波形（P波）、口針在液體中移動波形（M波）、主動抽吸波形（I波）和口針在液體中的未知波形（X波）。采用飼喂模式分析褐飛虱取食不同濃度蔗糖溶液的刺吸行為，發(fā)現褐飛虱對2.50%～20.00%濃度范圍的蔗糖溶液吸食時間較長，尤其是5.00%和20.00%蔗糖組的褐飛虱有一半左右的記錄時間處于主動吸食狀態(tài)。蔗糖溶液在用于褐飛虱EPG監(jiān)測的液體飼喂模式時，推薦5.00%～20.00%作為候選人工取食液濃度。

關鍵詞：褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）；液體飼喂模式；蔗糖；取食行為；刺探電位圖

中圖分類號：S435.112+3；S482.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1374-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.024

Abstract： Electrical penetration graph （EPG） was used to monitor the probing and sucking behavior of brown planthopper feeding with artificial liquid diet. The corresponding EPG waveforms were identified using the EPG waveforms of brown planthopper feeding with rice plants as reference. It results showed that there were 5 typical waveforms on liquid diet model correlated with feeding behaviors including non-probe（np）， stylet penetrating into liquid （P）， stylet moving in liquid （M）， active ingestion of liquid （I） and unknown behavior of stylet in liquid （X）. The feeding behavior of brown planthopper feeding on sucrose solution of different concentrations was studied using EPG technique on the liquid diet model. The results showed that the total time of ingestion waveforms in groups of 2.50%～20.00% sucrose solution was longer than that of the control group （in fresh water）. The brown planthopper in groups of 5.00% and 20.00% sucrose solutions was in active ingestion at half of the recording time. Therefore， 5.00%～20.00% sucrose solution is recommended as the candidate diet for the EPG recording of brown planthopper feeding on the liquid diet model.

Key words：brown planthopper（Nilaparvata lugens Stal）； liquid diet model；sucrose；feeding behavior； electrical penetration graph（EPG）

褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）是中國及亞洲水稻的主要害蟲，為典型的刺吸式昆蟲，主要通過口針刺吸韌皮部汁液對水稻植株造成危害，嚴重時發(fā)生水稻虱燒現象。褐飛虱的為害方式與其取食行為密切相關，其在植株上的取食行為已成為農業(yè)有害昆蟲研究的重要內容。

使用昆蟲取食監(jiān)測儀（刺探電位圖技術，Electronic penetration graph，EPG）是研究刺吸式昆蟲（蚜蟲、飛虱、葉蟬等）在植物組織內部取食行為的一種精確、直觀的方法[1-3]。通過記錄刺吸式昆蟲口針刺探和取食植物組織過程中產生的刺探電位波形特征，觀察昆蟲在植物組織內部的刺探和取食行為過程，能定量研究昆蟲在植物組織內部分泌唾液和刺吸汁液等取食行為。Mclean等[4]首次報道了刺探電位圖技術在豌豆蚜取食行為研究中的應用，刺探電位圖技術在稻飛虱取食行為中的應用研究始于20世紀80年代。刺探電位圖技術在褐飛虱取食行為中的刺吸波形所表示的生物學意義已越來越清楚[5-9]，并以此為基礎進行了褐飛虱在水稻品種上的取食行為及殺蟲劑、化學物質和環(huán)境因素對褐飛虱取食的影響等研究[10-13]。

由于刺吸式口器昆蟲與植物的相互關系比較復雜，昆蟲口針在植物體內的行為活動多樣，EPG監(jiān)測時波形多樣且復雜，而刺吸式口器昆蟲在取食人工飼料時口針行為較簡單，人工飼料可以為EPG監(jiān)測定性或定量研究刺吸式口器昆蟲取食行為提供單一且可重復的環(huán)境[14]。本研究采用EPG監(jiān)測褐飛虱對人工取食液的取食行為，參考褐飛虱取食水稻的EPG波形來解析人工取食液的EPG波形，并分析褐飛虱取食不同濃度蔗糖溶液時的刺吸行為差異，為基于液體飼喂的EPG監(jiān)測技術在褐飛虱取食行為研究中的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

采用室內長期飼養(yǎng)的褐飛虱為供試蟲源，選取羽化1～3 d的雌成蟲進行測試。采用汕優(yōu)63水稻植株飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（27±1） ℃，光周期為16 h∶8 h（L∶D）。

1.2 褐飛虱取食Parafilm膜下液體的刺吸行為監(jiān)測

采用四通道面板控制直流電型（DC-EPG型）昆蟲電子取食監(jiān)測儀進行監(jiān)測。Parafilm膜封液體法，將50 mL塑料三角杯去底面，用Parafilm膜封住底面，疊至盛有溶液的另一個三角杯中，再將植物電極插入溶液，注意在膜和液面之間不要有氣泡。先用二氧化碳短時間（15 s）麻醉褐飛虱雌成蟲（預先饑餓2 h），迅速用導電銀膠將一根細金線（直徑20 μm ，長10 cm）的一端與褐飛虱胸背板黏連，另一端相連至昆蟲電極。接通電流，使懸掛的試蟲在Parafilm膜上能自由活動，開始記錄。分設清水對照組（蔗糖濃度0）和7個蔗糖濃度組，分別為1.25%、2.50%、5.00%、10.00%、20.00%、40.00%和60.00%。每個處理10次以上有效重復，每次記錄重復用不同的昆蟲個體和溶液情況，記錄時間6 h。所有記錄均在室內進行，溫度為（26±1） ℃，相對濕度為70%±5%，光照條件為持續(xù)光照。

1.3 數據統(tǒng)計分析 采用SAS軟件的PROC MEANS程序算出試驗數據的平均值和標準差，用PROC GLM程序采用新復極差法檢驗處理間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 褐飛虱取食Parafilm膜下液體的EPG波形

相對褐飛虱取食水稻植株的EPG波形而言[7]，褐飛虱取食Parafilm膜下液體狀物質的EPG波形比較簡單（圖1），出現了幾種典型波形。

np波：非刺探波形。褐飛虱口針未刺入膜，這段時間的電壓一般維持在0基線，有時會因為昆蟲的活動而出現在基線上下呈不規(guī)律的脈沖波形，如在400 s左右出現的脈沖波形（圖1A）。褐飛虱取食液體的np波形與取食水稻植株的np波形相似。

P波：開始刺探波形。即口針刺破Parafilm膜的過程，此時電壓瞬時出現變化（圖1B）。該波形與取食水稻植株的N1波形基本一致，區(qū)別在于褐飛虱取食水稻植株的N1波形要比取食液體的P波形復雜，因為口針刺透Parafilm膜比刺破植物表皮要簡單得多。

M波：口針在液體中移動波形。此時沒有吸取液體，波形無規(guī)律（圖1B）。該波形與褐飛虱取食水稻植株的N2波形相似，不同的是M波形較簡單且持續(xù)時間很短。

I波：持續(xù)吸食波形。波形有規(guī)律，波頻一般為5～6 Hz，波幅較大（圖1C）。該波形與褐飛虱取食水稻植株的N5波形相似，都屬于口針主動吸食過程。

X波：未知波形。該波形不是每次記錄都出現，若出現往往是在較長時間的I波形之后。從I波形至X波形電壓瞬間下降，由波峰和平坦波線交替組成（圖1D）。波峰間隔隨時間延長而變大，剛開始時每6～7 s就會出現一波峰，往后波峰間隔有時會達到50～60 s。

2.2 褐飛虱取食不同濃度蔗糖溶液的刺吸行為

EPG監(jiān)測褐飛虱雌成蟲對Parafilm膜下清水和7個濃度蔗糖溶液的刺探和吸食行為，對監(jiān)測結果（表1）進行分析（表2）。無論是清水還是蔗糖溶液，褐飛虱取食都出現了“2.1”所述的幾種典型波形。表1列出在不同液體介質情況下褐飛虱取食波形的主要特征。

np波總持續(xù)時間：即非刺探總時間。濃度為2.50%、5.00%和20.00%蔗糖組的np波總持續(xù)時間顯著小于清水組，1.25%、10.00%、40.00%和60.00%蔗糖組的np波總持續(xù)時間與清水組相當。

P波出現次數：即記錄期間口針刺入次數。1.25%～20.00%蔗糖濃度范圍內，刺入次數與清水組相當，40.00%和60.00%蔗糖組口針刺入次數顯著增加。

M波總持續(xù)時間：M波為口針在液體內但是尚未吸取液體時的表征，通常比較短暫。1.25%～20.00%蔗糖濃度范圍內，該值與清水組相當，40.00%和60.00%蔗糖組M波總持續(xù)時間顯著增加。該值在不同蔗糖濃度間有差異，表現出與口針刺入次數、蔗糖濃度相關聯。

I波總持續(xù)時間：即褐飛虱主動抽吸液體過程的總時間。1.25%、40.00%和60.00%蔗糖組的褐飛虱吸食時間與清水組相當，在蔗糖濃度5.00%～20.00%范圍內的吸食時間明顯多于清水。圖2直觀顯示了不同濃度蔗糖溶液I波形總持續(xù)時間在總監(jiān)測時間中的占比，5.00%和20.00%蔗糖組的褐飛虱有一半左右的記錄時間處于主動吸食狀態(tài)。

I波出現次數：即褐飛虱主動抽吸液體的次數。隨著蔗糖濃度的增加，I波出現次數有增加趨勢。

X波總持續(xù)時間：X波為跟隨I波之后出現的未知波形。該值在不同濃度間有顯著差異，40.00%和60.00%蔗糖組的X波持續(xù)間短，1.25%蔗糖組的X波時間長。試驗中該波形在不同重復間出現很大差異，如20.00%蔗糖組10次有效重復中僅1次記錄中出現X波形，而2.50%蔗糖組15次有效重復中有10次記錄中出現X波形。X波形的出現似乎與I波形持續(xù)時間有關，但是尚未發(fā)現其具有明顯的規(guī)律性。

對褐飛虱雌成蟲在Parafilm膜下液體的刺吸波形進行了解析，并通過EPG監(jiān)測，發(fā)現褐飛虱成蟲對2.50%～20.00%濃度范圍的蔗糖溶液取食時間較長。

3 小結與討論

結合液體飼喂的EPG監(jiān)測技術已在多種昆蟲研究中應用[15-17]。金亮等[13]為研究植物源化合物對褐飛虱取食行為的影響，采用EPG監(jiān)測了褐飛虱口針對液態(tài)人工飼料的刺探行為，定義了5種波形，分別為N1波、N2波、N3波、E波以及非刺探波np波。其中np波、N1波、N2波和E波與本研究的np波、P波、M波和I波是基本一致的，但本研究沒有解析到N3波形，金亮等沒有解析到X波形。N1波、N2波和N3波的命名源自褐飛虱取食水稻植株的波形[6]，N3波即褐飛虱口針刺入篩管的過程，因為水稻韌皮部外圍有厚壁細胞，篩管旁還有伴胞，所以褐飛虱口針在進入篩管吸取汁液之前要穿透厚壁細胞和伴胞，會出現波幅很大的周期性波峰。取食Parafilm膜下液體時沒有這種穿透過程，也應該沒有N3波形，金亮等[13]觀測到的N3波根據其提供的波形圖來看，應該屬于N2波。本研究中的X未知波形與Trebicki等[16]所描述的南斑葉蟬（Orosius orientalis）取食液態(tài)飼料的O3波形極其相似。南斑葉蟬的O3波形通常跟隨在O2波形（在木質部內主動抽吸波形）之后出現，且其特征與本研究中的X波形相近，均由間斷出現的尖峰和平坦起伏的信號組合而成，而且波峰的頻率很?。?.02～0.05 Hz），O3波形也是隨機出現，其出現頻率明顯要小于O2，這些與本研究中的X波形基本一致。相似的波形也在另一種葉蟬Cicadulina mbila的研究中出現[16]，但該種波形的刺探屬性和口針位置尚不清楚。褐飛虱取食液態(tài)人工飼料時X波形的生物學意義有待進一步研究。X波形不經常出現，而且其出現的持續(xù)時間和次數不成規(guī)律，不會過多影響到采用液體飼喂模式進行監(jiān)測褐飛虱取食行為的應用研究。

對于液體飼喂模式中的液體物質及其濃度的選擇[6，17]，簡單的蔗糖飼料因其單一方便，且能基本滿足短期內昆蟲的營養(yǎng)需要，可以用于短期的觀測試驗（如以EPG記錄為目的的研究）。如果長期飼養(yǎng)或以觀測存活率為目的的研究就需要用較高營養(yǎng)成分要求的飼料來替代單一的蔗糖。對于EPG研究中蔗糖溶液濃度的選擇應根據昆蟲種類的不同而有所差異。已有采用生測方法觀察褐飛虱對不同濃度蔗糖攝取量的報道[18]，但鮮見在EPG研究中褐飛虱對不同濃度蔗糖的取食反應的報道。本研究監(jiān)測發(fā)現褐飛虱對5.00%～20.00%的蔗糖溶液取食時間最長，這與文獻[18]報道的褐飛虱對20.00%蔗糖溶液攝取量最大的結果基本對應。因此用于研究褐飛虱取食行為的液體飼喂可以采用5.00%～20.00%的蔗糖溶液作為液體飼料。

由于刺吸式口器昆蟲與植物相互關系復雜，昆蟲口針對植物的行為活動多樣，EPG監(jiān)測時波形多樣且復雜，而刺吸式口器昆蟲在取食人工飼料時口針行為較簡單，取食人工飼料的EPG監(jiān)測可以為定性或定量研究刺吸式口器昆蟲取食行為提供單一且可重復的環(huán)境[14]。本研究采用EPG監(jiān)測褐飛虱對人工取食液的取食行為，參考褐飛虱取食水稻的EPG波形來解析人工取食液的EPG波形，并分析褐飛虱取食不同濃度蔗糖的刺吸行為，為基于液體飼喂的EPG監(jiān)測技術在褐飛虱取食行為研究上的應用提供基礎。根據不同研究目的，液體飼喂的EPG記錄時間可以有所不同。由于沒有植物表面復雜的生物和化學等刺激因素，褐飛虱在人工液體飼喂條件下適應和刺探嘗試要耗費更長的時間，根據試驗觀察，6 h以上的記錄時間對于液體飼喂的褐飛虱是合適的。

使用液態(tài)人工飼料裝置與使用活體植株相比有更多的優(yōu)勢，取食液結構均一、簡單，因而刺探波形種類較少，波形識別更簡單可靠，避免了植物個體差異所帶來的影響，能夠更直接地反映刺吸昆蟲取食行為。由于蔗糖溶液中添加生物活性物質能夠方便地研究單一物質的作用，因此利用液體飼喂的EPG監(jiān)測技術評價生物活性物質對刺吸式口器昆蟲的影響已經成為生物活性物質作用研究中比較有效的方法。對褐飛虱在液體飼喂模式下的取食行為監(jiān)測可為褐飛虱取食行為研究提供候選的試驗模式，該模式可以廣泛用于研究殺蟲劑、其他化學物質、植物次生代謝物質以及環(huán)境因素等對褐飛虱取食行為的影響等方面。

參考文獻：

[1] 雷 宏，徐汝梅.EPG——一種研究植食性刺吸式昆蟲刺探行為的有效方法[J].昆蟲知識，1996，33（2）：116-120.

[2] 陳建明，俞曉平，程家安，等.定量研究刺吸式昆蟲取食行為的有效方法——電子取食監(jiān)測儀的原理和應用技術[J].浙江農業(yè)學報，2002，14（4）：237-243.

[3] 陳建明，俞曉平，程家安.電子取食監(jiān)測儀在植物抗蟲性研究中的應用[J].昆蟲知識，2005，42（5）：485-490.

[4] MCLEAN D L，KINSEY M D.A technique for electronically recording aphid feeding and salivation[J].Nature，1964，202（4939）：1358-1359.

[5] HAO P，LIU C，WANG Y，et al.Herbivore induced callose deposition on the sieve plates of rice： An important mechanism for host resistance[J]. Plant Physiol， 2008，146（4）：1810-1820.

[6] SEO B Y， KWON Y H， JUNG J K， et al. Electrical penetration graphic waveforms in relation to the actual positions of the stylet tips of Nilaparvata lugens in rice tissue[J]. Asia–Pacific Entomol，2009，12（2）：89-95.

[7] 何月平，陳 利，陳建明，等.吡蚜酮對水稻褐飛虱取食行為的影響[J].中國水稻科學，2010，24（6）：635-640.

[8] GHAFFAR M B，PRITCHARD J，FORDLLOYD B. Brown planthopper（N.lugens Stal） feeding behaviour on rice germplasm as an indicator of resistance[J].Plosone， 2011， 6（7）： e22137.

[9] HE Y， CHEN L，CHEN J， et al. Electrical penetration graph evidence that pymetrozine toxicity to the rice brown planthopper is by inhibition of phloem feeding[J].Pest Management Science，2011，67（4）：483-491.

[10] HATTORI M. Probing behavior of the brown planthopper， Nilaparvata lugens （Stal） （Homoptera： Delphacidae） on a non-host barnyard grass， and resistant and susceptible varieties of rice[J]. Appl Entomol Zool， 2001， 36（1）： 83-89.

[11] HATTORI M. Electronic monitoring of feeding and oviposition behaviour of rice planthopper and its application in plant resistance study[J]. Chinese J Rice Sci， 2003， 17（9）： 31-36.

[12] CAO T T， LU J， LOU Y G， et al. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers， Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera （Hemiptera： Delphacidae）： Effects on feeding and honeydew excretion[J]. Environmental Entomology， 2013，42（6）：1281-1291.

[13] 金 亮，俞曉平，邊亞琳，等.苦杏仁酸對褐飛虱取食行為影響的刺探電位測試分析[J].中國計量學院學報，2011（2）：95-101.

[14] 李曉敏，李靜靜，湯清波，等.煙堿對B型和Q型煙粉虱取食行為的影響——基于EPG和液體飼囊技術體系[J].中國農業(yè)科學，2013，46（10）：2041-2049.

[15] CLINE A R，BACKUS E A. Correlations among AC electronic monitoring waveforms， body postures， and stylet penetration behaviors of Lygus hesperus （Hemiptera： Miridae）[J]. Environmental Entomology， 2002， 31（3）： 538-549.

[16] TREBICKI P T，JALLINGII W F， HARDING R M， et al. EPG monitoring of the probing behaviour of the common brown leafhopper Orosius orientalis on artificial diet and selected host plants[J].Arthropod-Plant Interactions，2013，6（3）：405-415.

[17] 周延樂，趙秋劍，張永軍，等.綠盲蝽在人工飼料模型上刺吸波形EPG解析[J].環(huán)境昆蟲學報，2013（4）：7-9.

[18] SAKAI T，SOGAWA K. Effects of nutrient compounds on sucking response of the brown planthopper， Nilaparvata lugens（Homoptera： Delphacidae）[J]. Appl Entomol Zool， 1976，11：82-88.