摘要：為研究芳香化酶抑制劑（Aromatase inhibitor，AI）Letrozole對中華條頸龜（Mauremys sinensis）性別分化的影響，在（30.0±0.5） ℃下孵化受精卵，孵化20 d時涂抹不同質量濃度Letrozole，出殼稚龜暫養(yǎng)1周后進行性別鑒定。結果表明，去離子水對照組孵化子代稚龜雌性占63.64%，雄性和間性各占13.6%和22.73%，差異極顯著（P<0.01），說明該溫度下，中華條頸龜主要產(chǎn)雌性個體；AI處理組雄性率分別為88.89%、92.00%和95.00%，說明誘導雄性轉化作用較強（P<0.01），并且乙醇處理組和AI處理組均不會影響龜卵的孵化率（P>0.05）和孵化期（P>0.05）。對AI處理組的性腺進行組織學觀察，雌轉雄精巢曲細精管發(fā)育良好，組織結構典型；未完全雄性化的卵睪體，髓質有少量發(fā)育完整的曲細精管，皮層退化成薄薄的一層，組織結構處于睪丸與卵巢之間。在產(chǎn)雌溫度下， 性分化前使用AI能較好地誘導中華條頸龜由雌性轉為雄性。

關鍵詞：中華條頸龜（Mauremys sinensis）；芳香化酶抑制劑；性腺；性別分化

中圖分類號：Q45；Q959.6+3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1430-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.037

Abstract：In order to study effect of aromatase inhibitor on sex differetiation of Mauremys sinensis， eggs were daubed under 30.0±0.5 ℃ with aromatase inhibitors（Letrozole） in the 20th day of the hatching period. Sex identification of hatched hatchlings were carried out after holding one week. The results showed that female of hatched offspring was 63.64%， male and intersexual was 13.64% and 22.73% with the significant difference（P<0.01）. Mauremys sinensis produced mainly females. Among the three AI-treated groups，male rates were 88.89%，92.00% and 95.00% respectively. The 95% ethanol treated group and three AI-treated groups did not affect the turtle eggs hatching rate （P>0.05） and incubation period （P>0.05）. Histological observation of the gonads of the AI-treated group showed that female turn to male testes seminiferous tubules well developed and organizational structure was typical. There was incomplete masculinization of ovotestis body. A small amount of growth medulla completed seminiferous tubules. Cortical degraded into a thin layer between the or ganizational structure between the testis and ovary. It will provide important and useful information for husbandry and management of the M.sinensis.

Key words： Mauremys sinensis； aromatase inhibitor； sex gonad； sex differentiation

龜鱉動物性別決定模式主要為溫度依賴型性別決定機制（Temperature-dependent sex determination，TSD），即性別分化取決于胚胎發(fā)育過程中溫度敏感期（Temperature sensitive period，TSP）的環(huán)境溫度高低[1]。不利的環(huán)境溫度能夠干擾龜類孵化和性比，性比失調可能使很多物種成為瀕危保護動物，甚至導致動物種群的衰落或滅亡[2]。在龜鱉類資源嚴重破壞的現(xiàn)狀下，通過飼養(yǎng)繁殖，使用有效方法控制龜類性別分化，能提高繁育率。在養(yǎng)殖條件下控制龜類性比，通常采取調節(jié)孵化溫度方法，如有些龜類低溫產(chǎn)雄性、高溫產(chǎn)雌性[3-5]，或通過外源激素或內源激素調控改變龜類性別。外源雌激素（雌二醇 E2）處理孵化卵，可以誘導雄性溫度條件下的胚胎發(fā)育成雌性，但外源雄激素睪酮T處理卻不能誘導雌性溫度條件下孵化的卵發(fā)育成雄性，因為雄激素T被芳香化酶（Aromatase）催化后轉換成了雌激素E2[6]。AI可以抑制芳香化酶的活性，從而阻止雌二醇的合成，實現(xiàn)龜類性別的轉化，將雌性轉為雄性，該作用僅發(fā)生在基準溫度下[7，8]。AI在動物性別控制相關領域有一定研究，如對番鴨性腺分化的研究[9-11]，魚類性別逆轉的研究[12，13]等。

中華條頸龜（Mauremys sinensis）作為本土龜類，主要分布在海南、臺灣等地，由于過度獵捕和棲息環(huán)境破壞等原因，野生種群數(shù)量銳減，其已被列為瀕危物種[14]。2009年容銀燕等[15]對中華條頸龜性別決定機制進行初步研究，確定其屬于TSD機制，低溫主要產(chǎn)雄性，孵化率低；高溫主要產(chǎn)雌性，孵化率高。因此，本研究在高溫（產(chǎn)雌性個體）條件下孵化，于溫度敏感期采用AI處理胚胎，研究AI對中華條頸龜性別分化的影響，為解決瀕危龜類物種人工繁育問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗開展于2010和2011年中華條頸龜繁殖季節(jié)4～6月，試驗用卵為產(chǎn)出2～3 d的受精卵，胚盤明顯、正常，全部購自海南省文昌長壽園龜類養(yǎng)殖基地。

1.2 試驗藥品

試驗所用芳香化酶抑制劑來曲唑（Letrozole，Let）片劑為瑞士Novartis產(chǎn)品， 以95%乙醇溶液作為助溶劑， 配制3個不同質量濃度梯度（5、 10、 20 μg/μL）。

1.3 人工孵化和AI處理

試驗前采用1∶5 000高錳酸鉀溶液浸泡孵化箱、擦拭培養(yǎng)箱。試驗設置5個分組：空白對照組（去離子水）、95%乙醇、5 μg/μL AI、10 μg/μL AI、20 μg/μL AI，受精卵隨機分組，每組30枚，每個孵化箱15枚，并設置兩個平行組。孵化第21天（TSP）使用不同質量濃度Let各5 μL涂抹受精卵，兩個對照組進行同樣處理。孵化箱（22 cm×16 cm×9 cm）底鋪5 cm蛭石，放入受精卵，水平間隔0.5～1.0 cm依次排放，覆蓋2 cm蛭石。試驗設置孵化溫度（30.0±0.5） ℃，保持智能生化培養(yǎng)箱（型號HWS-250，寧波海曙賽福實驗儀器廠）空氣相對濕度為85%～90%，基質濕度為5%～10%，在孵化箱2 cm處插入水銀溫度計，以此水銀溫度計為準控溫。7 d后檢查，將未受精卵剔除。1.4 組織學分析

孵化稚龜，暫養(yǎng)1周，解剖取性腺，用Bouin’s液固定，石蠟包埋，切片厚度5 μm，蘇木精-伊紅染色，光鏡（MOTIC BA310-T）下觀察性腺發(fā)育狀況，并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)利用Excel 2003和SPSS 16.0軟件進行處理，均以X±S表示。單因素方差分析（ANOVA）檢驗AI對孵化期的影響；卡方（χ2）檢驗AI對孵化率和雄性率的影響。

2 結果與分析

2.1 AI對中華條頸龜孵化率和孵化期的影響

由表1可以看出，95%乙醇與去離子水對照組的孵化率和孵化期均無差異顯著性（χ2=0.02，df=1，P>0.05），95%乙醇溶液作為助溶劑不會影響胚胎發(fā)育。各處理組孵化率與對照組無顯著差異（χ2=1.20，df=1，P>0.05；χ2=1.11，df=1，P>0.05；χ2=0.46，df=1，P>0.05），各處理組孵化期差異不顯著。結果表明，在一定濃度范圍內，AI不會影響中華條頸龜胚胎發(fā)育速度和孵化率。

2.2 AI對中華條頸龜性腺分化的影響

由表2可以可知，去離子水和95%乙醇組均有雌性、雄性和間性個體，整體比較沒有差異顯著性（χ2=5.04，df=2，P>0.05），雄性率分別為13.64%和14.81%，差異不顯著（P>0.05）；雌性率分別為63.64%和59.26%，間性率分別為22.72%和25.93%，差異不顯著（P>0.05）。 結果表明， 在30 ℃下孵化，中華條頸龜主要產(chǎn)雌性個體，乙醇溶液對性別分化沒有影響。AI處理組雄性率均顯著高于對照組（P<0.01），且雄性率隨著處理濃度的升高而增加，5 μg/μL AI處理組達88.89%，20 μg/μL AI處理組最高95.24%，說明AI對中華條頸龜性別逆轉雄性化的作用效果顯著。

2.3 AI對中華條頸龜性腺影響的組織學變化

去離子水對照組和95%乙醇組性腺有卵巢、卵睪體（間性）和精巢，雌性個體卵巢結構典型，卵巢皮層發(fā)達，皮層內可見發(fā)育良好原始卵泡，髓質部退化形成卵巢腔（圖1A、B）；AI處理組僅有精巢和卵睪體，精巢的結構典型（圖1C、D、E）：皮層為一薄層呈白膜狀，髓質增生，毛細血管豐富，有眾多不規(guī)則曲細精管切面，曲細精管內清晰可見精原細胞和初級精母細胞。對照組和AI處理組均有卵睪體，對照組卵睪體組織細胞大小相近，未見明顯的卵泡和曲細精管分化；AI處理組卵睪體的組織結構（圖1F），皮層和髓質分界不明顯，皮層中可見零星卵母細胞和初級卵泡，這些卵泡與正常卵巢中卵泡的結構相似，但大小和數(shù)目均有所減少；髓質部細胞分裂旺盛，大小相近，密集排列呈束，曲細精管的結構較正常睪丸內曲細精管少，分布較為分散，發(fā)育不完善。

3 小結與討論

AI主要通過抑制或降低芳香化酶活性，阻礙類固醇激素的正常代謝途徑，使類固醇激素的生成量發(fā)生變化，從而影響脊椎動物正常性別分化和性腺發(fā)育，使雄性率增加，或使雌性動物轉變成雄性。Crews[7]和Richard-Mercier等[8]用芳化酶抑制劑阻止雌二醇的合成可以引起正在發(fā)育的胚胎發(fā)育為雄性，而不發(fā)育為雌性，認為該作用只發(fā)生在基準溫度下。不同孵化溫度條件下，TSP時期性腺芳香化酶的活性不同，在25 ℃（產(chǎn)生全雄的溫度）精巢的分化中，芳香化酶活性很低，在30 ℃（產(chǎn)生全雌的溫度）卵巢的分化中，芳香化酶活性達到最高[16]。據(jù)容銀燕等[15]研究報道，29 ℃條件下孵化中華條頸龜卵，雄性率為13.6%，31 ℃時雄性率為4.2%。本試驗在產(chǎn)雌的溫度（30 ℃）下孵化，AI也可誘導性腺發(fā)育為雄性，雄性率達到90%。說明利用芳香化酶抑制劑Letrozole處理龜胚，可以通過抑制龜胚性腺中芳香化酶活性，抑制雌激素的合成，進而促使雄性生殖細胞增殖，完成性別轉化過程。

在提高雄性率的同時不影響孵化率，孵化率仍達到90%以上。說明在龜類養(yǎng)殖中可利用AI控制龜類性別，滿足生產(chǎn)需求，提高經(jīng)濟效益，預示芳香化酶抑制劑在生產(chǎn)實踐中具有廣闊的發(fā)展前景。

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