摘要：試驗(yàn)以涼山半細(xì)毛羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用RT-PCR方法克隆了其IGFBP-7基因的CDS全序列，生物信息學(xué)方法深入分析其序列。結(jié)果表明，涼山半細(xì)毛羊IGFBP-7基因的CDS序列為846 bp，編碼282個(gè)氨基酸，與牛、人、鼠的CDS同源性分別為99%、95%、90%，氨基酸序列同源性分別為98%、93%、89%，GenBank登錄號(hào)為FJ589640.1；IGFBP-7基因的氨基酸分子質(zhì)量為29.0 ku，理論等電點(diǎn)（pI）為8.25；進(jìn)化分析顯示其與牛、山羊等哺乳動(dòng)物關(guān)系較近，與斑馬魚、鮑等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；IGFBP-7基因的蛋白質(zhì)疏水性區(qū)域與親水性區(qū)域間隔較為均勻分布，有1個(gè)信號(hào)肽、 2個(gè)跨膜區(qū)、16個(gè)磷酸化位點(diǎn)、 4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)；二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示無規(guī)卷曲、α-螺旋和β-折疊區(qū)域分別為64.89%、19.86%、15.25%；三級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示存在IGFBP_N和Ig-like功能域。該試驗(yàn)為進(jìn)一步研究綿羊IGFBP-7基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：綿羊；IGFBP-7基因；克??；序列分析

中圖分類號(hào)：S826；Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）06-1416-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.034

Abstract： The whole CDS sequence of IGFBP-7 gene was cloned from Liangshan semi-fine wool sheep and sequenced with RT-PCR and bioinformatics. The results showed that the CDS sequence of IGFBP-7 gene was 846 bp， encoding 282 amino acids. Its CDS homology with bovine， human and rat was 99%， 95% and 90%， respectively. The registry number in GenBank was FJ589640.1. Analysis of the amino acid sequence revealed that it was close to mammals such as cattle and sheep and far from Haliotis diversicolor， fish， etc. Its molecular weight was 29.0 ku， with the theoretical isoelectric point of 8.25. The hydrophobic and hydrophilic regions in IGFBP-7 gene distributed uniformly. It had a signal peptide， two transmembrane region，16 sites of phosphorylation， 4 sites of N-glycosylation and 1 sites of O-glycosylation. The analyses of secondary structure showed that the random coil， α-helix and β-sheet region were 64.89%，19.86% and 15.25%， respectively. It had IGFBP_N domain and a Ig-like domain. It will provide a scientific basis for further studying on the function of IGFBP-7 gene in sheep.

Key words： sheep；insulin growth factor binding protein-7 gene（IGFBP-7 gene）； clone； sequence analysis

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（IGFBP-7）是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族（IGFBPs）的成員之一，在不同物種的不同組織中發(fā)現(xiàn)，各自進(jìn)行了命名，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1（IGFBP-rP1）[1]、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（IGFBP-7）、MAC25[2]、腫瘤黏附因子（TAF）[3]和前列腺素刺激因子（PSE）[4]等都是同一種蛋白。在對(duì)其他物種的IGFBP-7的結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)，IGFBP-7有類似于IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5和IGFBP-6等高度保守的N端結(jié)構(gòu)域，位于信號(hào)肽之后80～93個(gè)氨基酸殘基區(qū)域[5]，IGFBP-7的N端還含有整個(gè)氨基酸序列的18～20個(gè)半胱氨酸（Cys）中的12個(gè)，是高度保守的半胱氨酸富含區(qū)域，N端偶數(shù)個(gè)Cys形成的二硫鍵有利于維持IGFBPs三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[6]。

IGFBP-7基因的功能與IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5和IGFBP-6等基因一致，主要表現(xiàn)為IGF依賴和獨(dú)立于IGF的作用，在IGF信號(hào)通路中，IGFBPs、IGFs和IGF-1R的信號(hào)傳遞過程通過絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化激活作用最終開啟細(xì)胞內(nèi)MAPK激酶途徑和P13激酶途徑，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而來調(diào)控細(xì)胞活性、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移及蛋白質(zhì)合成的變化[5]。有關(guān)綿羊IGFBP-7基因的序列分析、單核苷酸多態(tài)性等報(bào)道較少。本研究以涼山半細(xì)毛羊?yàn)檠芯繉?duì)象，克隆了其IGFBP-7基因的全CDS序列，利用生物信息學(xué)方法分析了CDS序列及相應(yīng)的氨基酸序列，為進(jìn)一步研究該基因在綿羊生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用以及標(biāo)記的輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以四川省涼山州布拖縣的涼山半細(xì)毛羊原種場(chǎng)的7～9月齡的涼山半細(xì)毛羊母羊?yàn)樵囼?yàn)材料，采用頸靜脈放血，宰殺后10 min內(nèi)收集肝臟組織，浸泡于Sample Protector（寶生物）試劑中，置放于液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)

參照NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的普通牛（Bos taurus）的IGFBP-7基因（NM_001102300）的mRNA序列，采用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，Oligo 6.0進(jìn)行引物評(píng)價(jià)，采用NCBI網(wǎng)站的Blast工具檢索比對(duì)以驗(yàn)證引物特異性，IGFBP-7引物序列為F：5′-ACGCCATGGAGCGGCCGCTGC-3′，R：5′-TTA

CAGCTCAGCACCTTCACCTT-3′，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3 總RNA的提取

取涼山半細(xì)毛羊的肝臟組織約100 mg，迅速把組織放入預(yù)冷好的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入液氮，直至組織被研磨成粉末狀，采用RNA的Trizol提取法提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性，核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA提取的濃度與純度，提取的RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR擴(kuò)增

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行， 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s終止反應(yīng)。以合成的第一條cDNA鏈為模板，以IGFBP-7基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，62 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。

1.5 RT-PCR產(chǎn)物克隆

將回收的RT-PCR產(chǎn)物與PMD 18-T載體連接，載體與片段的摩爾比控制在1∶2～10，根據(jù)凝膠電泳或核酸蛋白儀檢測(cè)后的濃度及載體與片段分子大小來計(jì)算其摩爾比。輕輕渦旋離心管以混合內(nèi)容物，短暫離心，將混合反應(yīng)液置于16 ℃水浴中過夜連接。用滅菌牙簽挑取單個(gè)白色菌落，接種于含有Amp的1.5 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日吸取1 μL菌液作模板，依據(jù)RT-PCR擴(kuò)增體系和條件進(jìn)行PCR鑒定，通過1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)目的條帶。據(jù)菌液PCR檢測(cè)結(jié)果，吸取含有目的條帶的1 mL菌液，送往Invitrogen公司測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序結(jié)果與測(cè)序峰圖結(jié)合進(jìn)行校對(duì)，尋找基因的起始密碼子與終止密碼子，確定基因的編碼區(qū)序列。用NCBI的Blast服務(wù)器和Clustal W軟件進(jìn)行序列的同源性分析。核酸序列與其他物種比對(duì)后，利用Expasy服務(wù)器（http：//au.expasy.org/tools/）相關(guān)軟件預(yù)測(cè)各個(gè)基因的氨基酸序列的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和氨基酸組成等，將序列提交到ExPASy ScanProsite、HNN、SWISS-MODEL服務(wù)器，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)、N-磷酸化位點(diǎn)、O-磷酸化位點(diǎn)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能域等。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增

從涼山半細(xì)毛羊的肝臟中提取到的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖疑膠電泳后可以清晰地觀察到3條帶。由圖1可見。以遷移率從大到小依次是5 S rRNA、18 S rRNA、28 S rRNA，28 S rRNA條帶亮度大約為18 S rRNA條帶的兩倍，5 S rRNA條帶亮度較低，總RNA樣品完整、降解較少、質(zhì)量良好。以涼山半細(xì)毛羊的肝臟組織的cDNA為模板，用IGFBP-7基因的引物擴(kuò)增，得到的長度約850 bp，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2。

2.2 序列分析

根據(jù)正反測(cè)序進(jìn)行校正，采用DNAMAN去除載體序列和尋找上下游引物序列，確定各個(gè)基因編碼氨基酸的CDS序列，IGFBP-7基因的完整CDS序列長度為846 bp，編碼282個(gè)氨基酸。利用NCBI中的Blast程序比對(duì)克隆的涼山半細(xì)毛羊IGFBP-7基因與近源物種的同源性，結(jié)果表明，涼山半細(xì)毛羊IGFBP-7基因與牛、人、鼠的CDS區(qū)的同源性分別為99%、95%、90%，氨基酸序列同源性分別為98%、93%、89%；同源性比對(duì)結(jié)果顯示克隆的序列為綿羊IGFBP-7基因的CDS序列，將PCR擴(kuò)增得到的序列提交到NCBI，登錄號(hào)為FJ589640.1。

利用BioEdit軟件對(duì)此次試驗(yàn)克隆得到的涼山半細(xì)毛羊IGFBP-7基因的CDS編碼區(qū)的堿基組成成分進(jìn)行分析（圖3），其A、C、G和T等4種堿基組成含量分別為18.49%、31.45%、33.69%和16.37%，單鏈分子質(zhì)量為259.0 ku，雙鏈分子質(zhì)量為518.0 ku；氨基酸分子質(zhì)量為29.0 ku， 理論等電點(diǎn)（pI）為8.25。

2.3 IGFBP-7基因的分子進(jìn)化

從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫下載牛、鼠、人、雞、斑馬魚和鮑等物種的IGFBP-7基因的氨基酸序列，用Mega 6.06軟件的Neighbor-Joining程序構(gòu)建涼山半細(xì)毛羊IGFBP-7基因的分子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），可見其IGFBP-7基因與其他物種的進(jìn)化關(guān)系跟傳統(tǒng)的分類比較一致，綿羊與牛關(guān)系最近，最先聚合，隨著親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近逐步與豬、人、鼠、雞、斑馬魚和鮑聚合。

2.4 蛋白質(zhì)特性預(yù)測(cè)

2.4.1 疏水性分析 蛋白質(zhì)的疏水性分析采用ExPASy在線平臺(tái)的ProtScale程序計(jì)算綿羊IGFBP-7基因的疏水性圖譜。結(jié)果（圖5）表明，IGFBP-7基因的N段區(qū)域與C段區(qū)域，疏水性區(qū)域與親水性區(qū)域間隔較為均勻分布，因此，預(yù)測(cè)IGFBP-7基因與IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因的結(jié)合相對(duì)較弱。

2.4.2 信號(hào)肽分析 根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性分析，IGFBP-7基因的蛋白質(zhì)可能存在信號(hào)肽，將IGFBP-7基因的氨基酸序列提交到SignalP 3.0服務(wù)器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），結(jié)果（圖6）表明，IGFBP-7基因的蛋白質(zhì)的N段存在信號(hào)肽的概率為0.999，信號(hào)肽的長度為26個(gè)氨基酸殘基，切割位置為Ser-Ser之間。

2.4.3 跨膜區(qū)分析 聯(lián)網(wǎng)到“http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html”進(jìn)行蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)。結(jié)果（圖7）表明，IGFBP-7基因存在3個(gè)跨膜區(qū)，剔除信號(hào)肽位置處的跨膜區(qū)，該基因存在兩個(gè)跨膜區(qū)，分別為98-114和169-192兩個(gè)位置處。

2.4.4 磷酸化和糖基化位點(diǎn) 利用NetPhos 2.0在線磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)服務(wù)器，對(duì)克隆的IGFBP-7基因的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）。結(jié)果（圖8）表明，IGFBP-7基因中共發(fā)現(xiàn)16個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為Ser（12）、Thr（2）、Tyr（2）。

利用NetNGlyc1.0及NetOGlyc3.1服務(wù)器，對(duì)克隆的IGFBP-7基因的分子進(jìn)行N-糖基化和O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）。結(jié)果（圖8）表明，IGFBP-7共有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別位于171、194、215、252位置；有1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，位于155位置。

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用HNN在線二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)器，對(duì)IGFBP-7蛋白預(yù)測(cè)（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_nn.html）。結(jié)果（圖9）表明，IGFBP-7以無規(guī)卷曲為主，其次為α-螺旋，β-折疊最少。IGFBP-7的無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-折疊區(qū)域分別占64.89%、19.86%、15.25%。

2.6 蛋白質(zhì)功能域預(yù)測(cè)及分析

將序列提交到ExPASy ScanProsite（http：//www.expasy.org/tools/scanprosite/）結(jié)構(gòu)域分析數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的查找與分析。結(jié)果（圖10）表明，克隆的IGFBP-7基因的N端具有一個(gè)IGFBP_N功能域序列，位于28-114；在C端，IGFBP-7具有一個(gè)Ig-like（160-264）域，含有一個(gè)二硫鍵（181-248）。

3 小結(jié)與討論

蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙?；?，在所克隆的6個(gè)基因中，以在線預(yù)測(cè)存在大量的磷酸化和糖基化等修飾過程。磷酸化是通過蛋白質(zhì)磷酸化激酶將ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)上的過程，大部分細(xì)胞過程實(shí)際上是被可逆的蛋白質(zhì)磷酸化所調(diào)控的，至少有30%的蛋白質(zhì)被磷酸化修飾[7，8]。磷酸化的作用位點(diǎn)為蛋白質(zhì)上的Ser、Thr和Tyr殘基，在磷酸化調(diào)節(jié)過程中，細(xì)胞的形態(tài)和功能都發(fā)生改變，可逆的磷酸化過程幾乎涉及所有的生理及病理過程，如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生、新陳代謝、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮以及細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化等。在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，作為細(xì)胞信號(hào)的一些激素或細(xì)胞因子與細(xì)胞膜受體或細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合并被激酶激活，激素或信號(hào)因子隨著激酶的磷酸化也被磷酸化，引起細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)效應(yīng)。IGFBP-7蛋白共發(fā)現(xiàn)16個(gè)磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。

IGFBP-7在保守的N-端區(qū)域存在12個(gè)Cys，形成6個(gè)二硫鍵，其二硫鍵是以相鄰的2個(gè)Cys依次而構(gòu)成，形成IGFBP-7的第一亞域，在C-端的保守區(qū)域內(nèi)存在2個(gè)Cys，形成1個(gè)二硫鍵，構(gòu)成第二亞域，在綿羊的IGFBP-7蛋白氨基酸序列的二硫鍵跟人的研究一致[9，10]，經(jīng)二硫鍵折疊形成穩(wěn)定、精細(xì)的IGFBP-7的球狀結(jié)構(gòu)，保證了高級(jí)結(jié)構(gòu)與IGFs結(jié)合的親和力。IGFBP-7的ACGCCXXC取代了GCGCCXXC序列[11]，取代了IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4和IGFBP-5等的GCGCCXXC序列，可能導(dǎo)致了IGFBPs與IGFs結(jié)合的差異。IGFBP-7在N-端都具有一個(gè)完整IGFBP_N功能域序列和一個(gè)Ig-like域。正因IGFBP-7具有的Ig-like域而表現(xiàn)出與IGFs較低的親和力，反而與胰島素具有較高的親和力。

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