摘要：對大花杓蘭（Cypripedium macranthum Sw.）內生真菌類群組成及多樣性進行了分析。結果表明，從大花杓蘭植株中分離到內生真菌59 株，利用ITS-rDNA序列分子鑒定法將大花杓蘭內生真菌鑒定為18 個分類單元，分布在7綱9目11科16屬。北京大花杓蘭內生真菌包括12個屬，內生真菌的多樣性指數(shù)H=1.39、D=0.96，優(yōu)勢菌群為毛殼菌屬（Chaetomium）和莖點霉屬（Phoma）真菌，分別占總菌株數(shù)的15.25%和8.47%；吉林大花杓蘭樣品內生真菌歸于9個屬，內生真菌的多樣性指數(shù)H=1.31、D=0.93，以毛殼菌屬（Chaetomium）為優(yōu)勢菌群，占總菌株數(shù)的23.73%。由此可見，北京大花杓蘭中內生真菌多樣性高于吉林大花杓蘭。

關鍵詞：大花杓蘭（Cypripedium macranthum Sw.）；內生真菌；分離；鑒定；多樣性

中圖分類號：Q939.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1357-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.019

Abstract： The composition and diversity of endophytic fungal taxa in Cypripedium macranthum Sw was analyzed. The results showed that a total of 59 fungal strains were isolated from C. macranthum. These fungi were belonged to 18 taxa containing 7 classes， 9 orders， 11 families and 16 generas with analyzing ITS-rDNA sequence. Endophytic fungal groups in Beijing C. Macranthum included to 12 generas， with the diversity index H of 1.39 and D of 0.96. Chaetomium（15.25%） and Phoma （8.47%） were two major fungal groups. Endophytic fungal groups in Jilin C. Macranthum included 9 generas， with the diversity index H of 1.31 and D of 0.93.Chaetomium belonged to the core group（23.73%）. Diversity of endophytic fungi in Beijing C. Macranthum was higher than that of Jilin C. Macranthum.

Key words：Cypripedium macranthum； endophytic fungi； isolation； identification； diversity

大花杓蘭（Cypripedium macranthum Sw.）為蘭科杓蘭屬植物，其花大而艷麗，不僅是名貴的觀賞花卉，還是瀕危緊缺的藥用植物，對全身浮腫、小便不利、風濕性腰腿痛、帶下及跌打損傷等具有治療作用[1]，療效確切，經濟價值很高。由于該植物的生態(tài)環(huán)境遭到嚴重破壞，資源幾近枯竭。大花杓蘭的繁殖率很低，雖可以產生大量的成熟種子，但因不含胚乳，自然條件下極難萌發(fā)。研究表明，幾乎所有蘭科植物均與真菌形成共生關系，很多內生真菌能促進蘭科植物的種子萌發(fā)，加快植株的生長，提高繁殖率，增加宿主抗逆性，產生許多藥用成分和新化合物等。通過對大花杓蘭內生真菌的多樣性進行研究，以期更加深入地了解大花杓蘭與內生真菌的共生關系，為利用內生真菌促進大花杓蘭種子萌發(fā)和生長，實現(xiàn)大花杓蘭的快速繁殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為大花杓蘭，分別采自北京市房山區(qū)百花山和吉林省通化縣富江鄉(xiāng)。

1.2 培養(yǎng)基

所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂12 g，去離子水1 000 mL）。

1.3 方法

1.3.1 內生真菌的分離 隨機選取大花杓蘭健康的根、莖、葉，用清水洗凈，切成1 cm左右小段。采用體積分數(shù)為70%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗，3% 次氯酸鈉浸泡消毒，根、莖、葉消毒時間分別為2 min、4 min、1 min。無菌條件下，將材料剪成0.2 cm小段，置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)。待組織長出真菌菌絲，挑取菌絲先端接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)完成后，4 ℃保藏。

1.3.2 內生真菌的純化 將PDA斜面培養(yǎng)基保藏的內生真菌接種至PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)6～7 d，根據(jù)內生真菌的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征，合并形態(tài)一致的菌株。

1.3.3 內生真菌的分子鑒定 內生真菌依據(jù)rDNA的內部轉錄間隔區(qū)（ITS）序列進行分子鑒定。內生真菌DNA提取采用CTAB法[2]，用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[3]擴增ITS1，5.8S和ITS2的全序列。PCR反應體系50 μL：10×PCR Buffer 5 ？滋L，25 mmol/L MgCl2 1 ？滋L ， 10 mmol/L dNTP 2 ？滋L ，10 ？滋mol/L上下游引物各1.5 ？滋L ，1.0 U/μL Taq酶 2 ？滋L ，5 ？滋g/mL DNA模板2 ？滋L，ddH2O 35 ？滋L。PCR熱循環(huán)程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性l min，55 ℃引物復性45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃充分延伸8 min。PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序。將不同真菌的ITS序列在GenBank中進行BLAST分析，尋找與查詢序列相似性大于95%[4]的rDNA ITS序列，利用ClustalX 1.83軟件進行全序列比對[5]，用Paup* 4b10軟件[6]進行聚類分析，構建最大鄰接樹。根據(jù)聚類結果，對內生真菌進行分子鑒定。

1.3.4 大花杓蘭內生真菌多樣性分析 度量在一個特定的植物組織樣品中內生真菌的豐度，采用分離頻率和多樣性指數(shù)等指標[7，8]。分離頻率可以反映出某種真菌在植物中出現(xiàn)的頻率，多樣性指數(shù)反映每種植物內生真菌的物種多樣性程度。

分離頻率（isolation frequency，IF）：分離到的某一指定類型內生真菌的菌株數(shù)占分離內生真菌總菌株數(shù)的百分率。

Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)（H），H=-Σ（Pi）（lnPi）；Simpson多樣性指數(shù)（D），D=1-Σ（Pi）2，式中Pi為給定的菌種i的菌株數(shù)量占真菌總數(shù)量的比例。

采用Sorenson（Cs）相似性系數(shù)比較兩地之間內生真菌種類組成的相似程度。Cs=2j/（a+b），式中，j為兩個樣地共有種數(shù)或屬數(shù)；a和b分別為樣地A和樣地B的物種數(shù)或屬數(shù)。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的分離與鑒定

從大花杓蘭材料中共分離出59株內生真菌，對各菌株及與其ITS序列相似性大于95%的已知真菌的ITS序列進行BLAST分析，構建最大鄰接樹，獲得與待測菌株聚在同一分支且相似性最大的已知真菌。根據(jù)序列相似性原則[9]，進行菌種的鑒定，若相似性≥99%，可鑒定到種；相似性為95%～99%，可鑒定到屬；相似性<95%，可鑒定到科。59株內生真菌中57株分別歸于16個屬，有1株內生真菌只能鑒定到綱，為糞殼菌綱（Sordariomycetes）真菌，另有1株內生真菌只能鑒定到科，為肉座菌科（Hypocreaceae）真菌。其中，毛殼菌屬（Chaetomium）和莖點霉屬（Phoma）真菌為優(yōu)勢菌群，分別占總菌株數(shù)的38.98%和10.17%（表1）。

2.2 內生真菌的分布

2.2.1 不同器官內生真菌的分布 不同地區(qū)的大花杓蘭不同器官內生真菌的數(shù)量具有一定差異，北京百花山大花杓蘭共分離出28株內生真菌，其中根中分離出18株，莖中分離出7株，葉片中分離出3株。吉林通化大花杓蘭共分離出31株真菌，其中根中分離出23株，莖中分離出5株，葉片中分離出3株。由此可見，大花杓蘭根中內生真菌的數(shù)量高于其他部位，而葉中的數(shù)量最少。

2.2.2 不同地區(qū)大花杓蘭內生真菌的分布 北京大花杓蘭樣品內生真菌的種類比吉林大花杓蘭樣品多，北京大花杓蘭內生真菌歸屬于12 個屬和1個科，優(yōu)勢菌群為毛殼菌屬和莖點霉屬真菌，分別占總菌株數(shù)的15.25%和8.47%；吉林大花杓蘭樣品內生真菌歸屬于9個屬和1個綱，以毛殼菌屬為優(yōu)勢菌群，占總菌株數(shù)的23.73%（表1）。有5個屬的真菌均在兩地的大花杓蘭中出現(xiàn)，兩個樣地內生真菌組成相似性系數(shù)Cs=0.43，說明北京和吉林兩地大花杓蘭內生真菌組成具有一定的相似性。

2.3 大花杓蘭內生真菌多樣性

多樣性指數(shù)主要與內生真菌的種類數(shù)量和個體分配的均勻性有關。北京大花杓蘭內生真菌的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)H=1.39，Simpson多樣性指數(shù)D=0.96；吉林大花杓蘭內生真菌的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)H=1.31，Simpson多樣性指數(shù)D=0.93；兩地大花杓蘭內生真菌的多樣性存在差異，北京大花杓蘭內生真菌的多樣性略高于吉林大花杓蘭內生真菌。

3 小結與討論

植物內生真菌的分離多采用組織分離法，即將表面消毒后的植物組織置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，繼而分離內生真菌，根據(jù)宏微觀形態(tài)特征和分子生物學方法鑒定菌種，進行多樣性分析。任何一種培養(yǎng)基均具有選擇性，不能將植物組織中所有內生真菌分離出來，這也是植物內生真菌研究的困境[10]，采用宏基因組測序分析法能更好體現(xiàn)植物組織中內生真菌的種類，但不能將內生真菌分離出來，所以組織分離法尚為當前獲得植物內生真菌的主要方法。

本研究采用組織分離法從大花杓蘭植株中分離得到內生真菌59株，利用ITS-rDNA序列分子鑒定的方法將其鑒定為18個分類單元，分布在7個綱9個目11科16個屬，優(yōu)勢菌群為毛殼菌屬（Chaetomium）和莖點霉屬（Phoma）真菌。喬元寶[11]在扁脈杓蘭內生真菌多樣性研究中也發(fā)現(xiàn)扁脈杓蘭中有毛殼菌屬、叢赤殼屬、鐮孢菌屬、鏈格孢屬、小鬼傘屬和木霉屬真菌的存在。張亞平[12]從大花杓蘭根中也分離得到毛殼菌屬、枝孢菌屬、光黑殼屬、Leptodontidium、鐮孢菌屬、木霉屬、青霉屬真菌，從山西杓蘭根中同樣分離到了Leptodontidium和毛殼菌屬真菌，在紫點杓蘭根中亦獲得Leptodontidium屬真菌。除上述類群的真菌外，杓蘭屬植物內生真菌還涉及到另外20個屬的真菌[11，12]，可見杓蘭屬植物內生真菌存在豐富的多樣性。

大花杓蘭不同器官內生真菌的數(shù)量存在一定的差異，根中分離到的內生真菌較莖和葉中多，葉中最少，可能與大花杓蘭為多年生草本植物有關。北京大花杓蘭和吉林大花杓蘭中只有5個屬的真菌同時存在，兩采樣地的大花杓蘭內生真菌多樣性存在差異，與張亞平[12]分離得到的大花杓蘭內生真菌的類群同樣存在差異，可見同一種植物在不同生境下具有不同的內生真菌群落組成，其多樣性受生境影響較大。這一點與Pecoraro等[13]對蘭科石豆蘭屬植物內生真菌的研究結果相似。

植物中蘊藏著豐富的內生真菌，內生真菌在植物中的分布受組織、年齡結構、生境等因素的影響， 其多樣性的研究往往受到內生真菌分離方法的制約。因此，在隨后的蘭科植物內生真菌研究中，應綜合考慮這些因素，全面調查蘭科植物內生真菌多樣性，獲得大量的內生真菌資源，為進一步尋找蘭科植物促生真菌以及篩選內生真菌來源的生物活性物質奠定基礎。

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