摘要：采用Sepax Gp-C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，以此測試條件分別測定了云南、四川、貴州、甘肅省出產(chǎn)的10批重樓（Rhizoma Paridis）藥材樣品HPLC色譜圖，以重樓HPLC 7號色譜峰為參照物，按照重樓HPLC指紋圖譜共有模式，建立了來自4個不同省產(chǎn)地10批重樓的HPLC指紋圖譜。通過相似度分析、聚類分析和主成分分析方法，對不同產(chǎn)地重樓進行鑒別研究。結果表明，10批重樓可以分為兩大類，甘肅省的重樓單獨為一類，其他3個省產(chǎn)地的重樓聚為另一類。同時該HPLC指紋圖譜檢測方法簡便快捷、重現(xiàn)性好，可用于重樓質(zhì)量控制，能夠?qū)崿F(xiàn)對重樓產(chǎn)地的初步鑒別。

關鍵詞：重樓（Rhizoma Paridis）；HPLC指紋圖譜；相似度分析；聚類分析；主成分分析

中圖分類號：Q949.71+8.23；R284.1；O21 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1407-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.032

Abstract： Sepax Gp-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm） column was used to establish HPLC fingerprints of ten batches of Rhizoma Paridis from four different habitats. The mobile phase was acetonitrile-phosphoric acid with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃. Detection wavelength was 210 nm. According to HPLC fingerprint patterns of the Rhizoma Paridis， No.7 peak was chosen as the internal reference peak， Hierarchical cluster analysis， similarity analysis and principal component analysis were used to identify Rhizoma Paridis from different regions. Results showed that 10 batches of Rhizoma Paridis were divided into two categories including Rhizoma Paridis from Gansu province and the other three origin of Rhizoma Paridis. The HPLC fingerprint was simple， reproducible and can be used for controlling polyphylla quality and determing the origin of Rhizoma Paridis.

Key words：Rhizoma Paridis； HPLC fingerprint； similarity analysis； hierarchical cluster analysis； principal component analysis

重樓（Rhizoma Paridis）為百合科（Liliaceae）重樓屬（Paris L.）植物云南重樓[P. polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand-Mazz.]或七葉一枝花[P. polyphylla Smith var chinensis（Franch.）Hara]等植物的干燥根[1]。重樓屬植物種類繁多，我國有19種、10個變種，其根莖均可入藥，主產(chǎn)于云南、貴州、四川、廣西等省（自治區(qū)）[2]。重樓屬是多年生草本植物，根狀莖肉質(zhì)，呈團塊狀圓柱形；作為中藥材，其藥用在中國有著悠久的歷史，自古以來就有許多關于它的記載。重樓性微寒，有小毒，歸肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于癰瘡、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、驚風抽搐等病癥[3]，是著名中成藥云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧等的主要組分。現(xiàn)代藥理研究結果表明，重樓具有抗腫瘤[3-5]、免疫調(diào)節(jié)、止血、治療心血管疾病等廣泛的藥理活性[6，7]，因而極具研發(fā)價值，并受到廣泛關注。

近年來隨著對重樓需求量的急劇增加，野生重樓基源植物被大肆采挖，使得重樓資源日漸枯竭，逐漸成為瀕臨消亡的珍稀物種；同時市場上假重樓也不斷出現(xiàn)。為了擴大重樓藥用基源，試驗采用HPLC指紋圖譜法，對國內(nèi)4個不同省產(chǎn)區(qū)的10批重樓進行質(zhì)量分析，通過指紋圖譜相似度比較和聚類分析等方法區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)重樓，從而更科學地全面評價不同來源地重樓藥材的質(zhì)量及其真?zhèn)?，為重樓的深入研究及其應用提供樣品鑒定和指紋信息，并為其質(zhì)量控制和擴大藥用基源提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材料 試驗共選取了云南、四川、甘肅及貴州省出產(chǎn)的共10批重樓藥材樣品，其樣品編號、來源地見表1。將不同產(chǎn)地的重樓藥材清洗干凈，于35 ℃烘干，粉碎后過60目篩，制成重樓藥材粉末，備用。

1.1.2 試劑 乙醇、甲醇和乙腈為色譜純；磷酸等其他試劑均為分析純；水為超純水（自制）。

1.1.3 儀器 主要有LC-2010A型高效液相色譜儀配紫外檢測器、四元泵溶劑淋洗系統(tǒng)和CLASS-VP色譜工作站（日本島津公司）；Mettler AE200型電子分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗條件選擇

1.2.1 提取溶劑 稱取S1重樓藥材粉末0.5 g，取4份，各置于具塞錐形瓶中，分別加入25 mL的乙醇、甲醇、70%甲醇、70%乙醇，都各自稱定重量（W），浸泡12 h后超聲提取60 min，放冷后再次稱重量，分別用乙醇、甲醇、70%甲醇、70%乙醇對應補足減少的重量至W，過濾，將濾液水浴揮干，用甲醇溶解，并轉移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，用0.45 μm的微孔濾膜過濾。然后用210 nm作為測定波長；色譜條件是色譜柱：Sepax Gp-C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）和0.05%磷酸（B）；洗脫程序：0～20 min，2% A；20～40 min，2%～5% A；40～80 min，5%～21% A；流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL；通過色譜分析確定提取溶劑類型。

1.2.2 提取方法 以往重樓藥材中活性成分的提取方法主要有加熱回流提取法和超聲提取法，試驗參照文獻[8，9]分別設置了加熱回流提取、直接超聲提取和浸泡12 h后超聲提取3種提取方法，即在加入提取溶劑后，用這3種方法分別提取、再進行“1.2.1”的后續(xù)試驗，通過色譜分析比較各方法的適合與否。

1.2.3 色譜分析的波長 分別在203、210、220、240 nm波長處對S1樣品進行測定，比較各處理波長對色譜分析結果的影響，從而確定試驗的測定波長參數(shù)。

1.2.4 色譜流動相 分別考察甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.05%磷酸溶液，甲醇-乙腈-水各流動相系統(tǒng)對色譜分析結果的影響，從而確定試驗的流動相取舍。

1.3 供試品溶液制備

稱取各重樓藥材樣品粉末0.5 g，都置具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%乙醇，稱定重量（W1），浸泡12 h后超聲提取60 min，放冷后再次稱重量，用乙醇補足減少的重量至W1，過濾，將濾液水浴揮干，用甲醇溶解，并轉移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，即作為供試品溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：Sepax Gp-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）和0.05%磷酸（B）；洗脫程序：0～20 min，2% A；20～40 min，2%～5% A；40～80 min，5%～21% A；流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，檢測波長210 nm 。

1.5 方法學考察

1.5.1 穩(wěn)定性試驗 取S1樣品供試溶液，在24 h內(nèi)每4 h測定1次，重復6次；以峰值最高的峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（RSD），以考察試驗方法的穩(wěn)定性能。

1.5.2 精密度試驗 取S1樣品供試溶液，連續(xù)進樣6次，記錄100 min內(nèi)的圖譜。以峰值最高的峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（RSD），以考察試驗方法的精密程度。

1.5.3 重復性試驗 取S1樣品，按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，再測定指紋圖譜，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（RSD），以考察試驗方法的重復性能。

1.6 指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理

1.6.1 相似度分析 分別將10批重樓樣品的色譜數(shù)據(jù)導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A國家藥典委員會）軟件里，以生成的特征指紋圖譜共有模式為對照，計算各批次樣品的相似度，考察色譜峰的一致性。

1.6.2 系統(tǒng)聚類分析 聚類分析能夠揭示樣品之間的關系，繼而對樣品進行分類，從而能提供的圖譜信息比較多，可作為中藥指紋圖譜應用于質(zhì)量控制的補充，這將在中藥材質(zhì)量控制及綜合評價分析中發(fā)揮作用。試驗采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，以相對峰面積為變量，對不同產(chǎn)地的10批重樓藥材做聚類譜系圖，進行聚類分析。

1.6.3 主成分分析 采用SIMCA-P11.0軟件，以10批重樓中7個共有峰為變量進行主成分分析，其中前兩個主成分的權重分別占總變異量的55.2%和34.5%（共計89.7%），取前2個主成分繪制主成分二維圖，以第一主成分值為橫坐標、第二主成分值為縱坐標作散點圖。

2 結果與分析

2.1 試驗條件的確定

2.1.1 提取溶劑 在乙醇、甲醇、70%甲醇、70%乙醇4個溶劑的色譜分析結果中，以采用70%乙醇提取的色譜峰數(shù)目較多，效果較好，所以試驗采用70%乙醇作為試驗的提取溶劑。

2.1.2 提取方法 在加熱回流提取，直接超聲提取和浸泡12 h后超聲提取3種提取方法的色譜分析結果中，發(fā)現(xiàn)加熱回流提取和浸泡12 h后超聲提取方法能夠取得相同的效果，而且浸泡后超聲提取法更方便、安全。故選擇浸泡12 h后超聲提取法作為試驗的提取方法。

2.1.3 色譜分析的波長 在203、210、220、240 nm 4個波長的色譜分析比較試驗里，發(fā)現(xiàn)波長在203 nm處的基線漂移較嚴重；在210 nm處的基線稍穩(wěn)定，色譜峰較多，峰信號較強；而在220、240 nm處的基線雖然更平穩(wěn)，但峰個數(shù)較少，峰信號較弱。故確定210 nm作為試驗的測定波長。

2.1.4 色譜流動相 在甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.05%磷酸溶液，甲醇-乙腈-水3個流動相的色譜分析比較試驗里，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動相的各峰達到分離效果，色譜峰形較好，并且經(jīng)過多次反復試驗得出了較理想的二元梯度洗脫條件，所以選擇乙腈-0.05%磷酸溶液作為試驗的流動相。

2.2 重樓指紋圖譜的建立

分別取不同產(chǎn)地的重樓樣品S1～S10制成供試品溶液，按選定的測試條件，測定所有供試品的HPLC色譜圖（指紋圖譜），結果見圖1。從圖1可見，HPLC色譜圖得到了若干個色譜峰，其中7號峰為重樓的主要指標成分，因其在重樓中的含量較高且相對穩(wěn)定，故將其作為參比峰。將各色譜峰保留時間與同一圖譜中參比峰保留時間的比值作為各色譜峰的相對保留時間；以相對保留時間定性，得到7個共有峰，共有峰的相對保留時間統(tǒng)計結果見表2，共有峰的相對峰面積統(tǒng)計結果見表3。從圖1、表2、表3可知，不同產(chǎn)地的重樓指紋圖譜存在較大的差異，其共有峰相對保留時間基本一致，但相對峰面積存在很大的不同，表明不同產(chǎn)地的重樓質(zhì)量之間存在相當?shù)牟町?，這與文獻報道的結果一致[10]。

2.3 方法學評價

2.3.1 穩(wěn)定性 在試驗條件下按穩(wěn)定性試驗評價方法測定重樓樣品S1的色譜峰相對保留時間和相對峰面積，結果S1各色譜峰相對保留時間的RSD均小于3.19%、相對峰面積的RSD均小于4.01%，S1的色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD都小于5%，說明供試品在測定的24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，顯示出試驗采用的方法使樣品的穩(wěn)定性良好。

2.3.2 精密度 在試驗條件下按精密度試驗評價方法測定重樓樣品S1的色譜峰相對保留時間和相對峰面積，結果S1各色譜峰相對保留時間的RSD均小于3.03%、相對峰面積的RSD均小于3.99%，S1的色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD都小于5%，說明試驗采用的供試品進樣精密度良好。

2.3.3 重復性 在試驗條件下按重復性試驗評價方法測定重樓樣品S1的色譜峰相對保留時間和相對峰面積，結果S1各色譜峰相對保留時間的RSD均小于2.55%、相對峰面積的RSD均小于4.07%，S1的色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD都小于5%，表明試驗采用的方法其重復性較好。

以上結果表明，試驗得到的重樓HPLC指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差基本一致，相似度較高，符合指紋圖譜研究的技術要求。

2.4 指紋圖譜的數(shù)據(jù)分析

2.4.1 相似度分析 在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件中計算10批重樓樣品的相似度，結果顯示，S1的相似度為0.968、S2為0.922、S3為0.589、S4為0.887、S5為0.836、S6為0.876、S7為0.564、S8為0.823、S9為0.678、S10為0.808。這個結果表明，10個不同產(chǎn)地的重樓總體上相似度較高，只有甘肅省的蘭州市、天水市重樓樣品（S3、S7）的相似度較低，說明蘭州市、天水市所產(chǎn)重樓在特征指紋色譜峰的相對大小及非共有峰上與其他產(chǎn)地之間還存在明顯差別，也反映出不同產(chǎn)地的重樓受當?shù)赝寥?、氣候和生態(tài)環(huán)境等的影響較大。

2.4.2 系統(tǒng)聚類分析 10批重樓樣品的聚類譜系圖見圖2。從圖2可見，10批重樓可分為兩大類，來自甘肅省的2個重樓樣品（S3、S7）可聚為一類，其他3?。ㄔ颇?、四川、貴州?。┑?個重樓樣品可聚為另一大類。并且同一產(chǎn)地的重樓其樣品間的距離比較近，如貴州省的S5和S6、甘肅省的S3和S7其樣品間的距離都非常接近，云南省的S1、S4、S8、S10 4個樣品間的距離比較近，說明貴州、甘肅、云南省的重樓質(zhì)量比較穩(wěn)定；而四川省的S2、S9樣品間距離偏遠，說明四川省的重樓間質(zhì)量差異較大，沒有明顯的地域特征。在不同產(chǎn)地方面，甘肅省所產(chǎn)重樓與其他產(chǎn)地的重樓距離最遠，說明甘肅省的重樓與其他產(chǎn)地的重樓具有明顯的區(qū)別，在化學成分上差異較大。貴州省的重樓（S5、S6）與云南省的重樓距離較近，但也能夠區(qū)分開，說明聚類分析的結果能夠?qū)崿F(xiàn)對重樓產(chǎn)地的初步判斷。

2.4.3 主成分分析 采用SIMCA-P11.0軟件進行主成分分析得到的結果見圖3。由圖3可知，10批重樓根據(jù)距離遠近可分為2個大區(qū)域，來自甘肅省的重樓S3和S7分布在第一主成分軸的靠左邊，與來自其他產(chǎn)地（云南，四川和貴州?。┑闹貥瞧x較遠，可視為一類；其他3個產(chǎn)地的重樓之間相距較近，可視為另一大類，這與前面聚類分析的結果是一致的。

3 討論

通過對云南、四川、貴州、甘肅4省10批的重樓HPLC色譜圖進行比較研究，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的重樓整體色譜峰峰形相似、相似度較高。但一些樣品在特征指紋色譜峰的相對大小及非共有峰上還存在明顯差異，說明不同產(chǎn)地的重樓受產(chǎn)地、氣候和生態(tài)環(huán)境等的影響較大；因此，為了保證中藥材、中藥生產(chǎn)中間體、中藥制劑等質(zhì)量的均一性、穩(wěn)定性和臨床用藥的安全性、有效性，必須對中藥材的品質(zhì)進行嚴格控制。試驗結果顯示，聚類分析和主成分分析將不同產(chǎn)地的重樓分為了兩類，其中來自四川、貴州、云南省的8批樣品聚為了一類，甘肅省的2批樣品聚為了一類。對云南、貴州、四川省的重樓進一步分析發(fā)現(xiàn)，這3個省產(chǎn)地的重樓也不能全部聚集在一起，只有云南省的4批重樓和貴州省的2批重樓能夠明顯區(qū)分開，具有顯著的區(qū)域性，與產(chǎn)地歸屬相符合。這個結果進一步說明重樓藥材的歸類與產(chǎn)地有較大的關系，建議在臨床應用中根據(jù)具體情況選用固定產(chǎn)地的重樓藥材。同時試驗還可為建立易操作的、規(guī)范化的重樓指紋圖譜體系提供參考，并可為重樓的品質(zhì)評價、質(zhì)量控制標準制定、GAP規(guī)范種植產(chǎn)地規(guī)劃和發(fā)展道地藥材生產(chǎn)提供指導。

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