摘要：為了建立激流灌注式生物反應(yīng)器規(guī)?；a(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的生產(chǎn)工藝，本研究以AP20C型生物反應(yīng)器為生產(chǎn)工具對豬繁殖與呼吸綜合征病毒R98株（PRRSV-R98）的增殖水平進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，應(yīng)用激流灌注式生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒96h達(dá)到最佳接毒時間，接種后36～39h收獲病毒液，效價較轉(zhuǎn)瓶提高十倍以上。

關(guān)鍵詞：Marc-145細(xì)胞；PRRSV-R98；激流灌注式生物反應(yīng)器

在豬的多種疾病中豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是危害全球養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。防治PRRS的最有效方法是使用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，因此，優(yōu)質(zhì)高效的病毒液是疫苗生產(chǎn)中非常重要的一個環(huán)節(jié)圜。

目前，商品化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗主要是通過傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)。我公司應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒R98株的批生產(chǎn)研究，取得較好效果?，F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞

Marc-145細(xì)胞由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司研發(fā)部保存、提供。

1.2 毒種

PRRSV-R98由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司種毒室保存、提供，效價107.3TCID50/mL。

1.3 主要設(shè)備

AP20C型激流灌注式生物反應(yīng)器，購自杭州安普生物工程有限公司。

1.4 主要試劑及生產(chǎn)廠家

高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶出自GIBCO，新生牛血清出自蘭州民海生物工程有限公司。

2 實驗方法

2.1 激流灌注式生物反應(yīng)器前期準(zhǔn)備及安裝

按照說明書檢驗系統(tǒng)氣密性，PBS平衡系統(tǒng)。校準(zhǔn)pH電極、溫度電極，極化溶氧電極，121℃高壓30min備用。連接管道、呼吸袋，安裝電極。

2.2 反應(yīng)器細(xì)胞接種及培養(yǎng)

取長成良好單層的10L轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞7個進(jìn)行消化，制備種子液6L，采用兩步法接種接種至生物反應(yīng)器。

設(shè)置設(shè)備參數(shù)如下：T1：37℃，T2：39.5℃，T3：36.5℃，pH： 7.3，D0：50%，震蕩速度45r/m，循環(huán)速度250mL/min，啟動細(xì)胞培養(yǎng)程序，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每12h取樣測殘?zhí)橇?，計算耗糖量，及時補(bǔ)充營養(yǎng)液，逐漸增大循環(huán)速度。

2.3 PRRSV-R98在生物反應(yīng)器中的接種及培養(yǎng)

通過檢測反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞耗糖量確定細(xì)胞生長狀況，當(dāng)糖耗量趨于平穩(wěn)且達(dá)到最大值時，接種PRRSV-R98懸液200mL并更換含2% FBS的細(xì)胞維持液。對病毒增殖過程的42h進(jìn)行監(jiān)測，每6h取樣測殘?zhí)?，接種后18h開始每3h取樣，測定培養(yǎng)液中的病毒滴度。 依此方法，連續(xù)完成04批、05批和06批3個批次生物反應(yīng)器的病毒培養(yǎng)。分析病毒增殖規(guī)律，觀察病毒峰值出現(xiàn)的時間，從而準(zhǔn)確把握最佳病毒收獲時間。

3 實驗結(jié)果

3.1 細(xì)胞接種培養(yǎng)

制備的細(xì)胞懸液中含細(xì)胞總數(shù)約2.3×109個，檢測04、05和06三個批次的耗糖可知反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞96h以后細(xì)胞耗糖趨于穩(wěn)定，細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大，達(dá)到最佳接毒時間。耗糖量變化（如圖1）。

3.2 PRRSV-R98在生物反應(yīng)器中的接種及培養(yǎng)

反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞接種PRRSV-R98后耗糖量變化與時間關(guān)系（如圖2）。

反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞接種PRRSV-R98病毒后耗糖高峰出現(xiàn)在30h前后，約為3.0～3.2g/L/24h。

生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系培養(yǎng)PRRSV-R98病毒滴度與時間變化關(guān)系（如圖3）。

應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)PRRSV-R98病毒產(chǎn)毒高峰出現(xiàn)在36～39h，約為108.3-8.7TCID50/mL。故最佳收獲時間為接毒后36～39h。

4 討論

應(yīng)用激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒既能實現(xiàn)細(xì)胞高密度生長，而且自動化水平較高，生產(chǎn)過程穩(wěn)定可控，降低了產(chǎn)品批間差異，從而大大提高了病毒抗原的產(chǎn)品質(zhì)量。

值得注意的是，激流灌注式生物反應(yīng)器生產(chǎn)工藝的收獲時間是根據(jù)廠家給出的經(jīng)驗值和實時糖耗水平來確定。本研究中，培養(yǎng)體系中耗糖高峰出現(xiàn)在30h前后，而其病毒滴度高峰出現(xiàn)在接毒后36～39h，如果我們根據(jù)耗糖結(jié)果來確定收獲時間將會直接導(dǎo)致病毒滴度不高。其原因可能是灌注袋內(nèi)細(xì)胞數(shù)量很大，接種病毒后細(xì)胞大量產(chǎn)毒致使耗糖量急劇增加，產(chǎn)生耗糖高峰；而此時細(xì)胞尚未破碎，隨時間的延長，大量細(xì)胞的病變、死亡將病毒釋放到培養(yǎng)液中達(dá)到一個峰值，使得此時培養(yǎng)液中病毒滴度最高。

研究還發(fā)現(xiàn)，灌注袋反復(fù)凍融后的病毒懸液效價較激流袋病毒液效價高出近10倍。可能是因為灌注袋中細(xì)胞數(shù)量很大，里層的細(xì)胞與外周培養(yǎng)液中的物質(zhì)交換較慢，細(xì)胞代謝水平、細(xì)胞的病毒感染和病毒增殖速度都較外層載體上的細(xì)胞低。如果上述理論成立，我們可以在效價高峰收獲病毒液后再向反應(yīng)器中注入新鮮維持液繼續(xù)培養(yǎng)，或者采用其他收獲方式，如流加收獲，充分利用所有的細(xì)胞，將有可能大幅度提高病毒產(chǎn)量。